凝胶柱最新分析和总结.pdf

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凝胶层析定义 凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰 性载体 ,不带电荷,吸附力弱,操作条件比较温和,可在相当广的温度范围下进 行,不需要有机溶剂,并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子 物质有很好的分离效果。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术,又 称之凝胶过滤,分子筛层析或排阻层析。 凝胶层析原理 凝胶层析的概念及其原理 单个凝胶珠本身象个 筛子 。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝 胶装入一个足够长的柱子中,作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加 到凝胶柱上时,比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部, 这样的小分子 不但其运动路程长,而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大,所以 越小的蛋白质, 把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长 ! 凝胶中只有很少的孔 径可接受大的蛋白。因此,大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下 来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。 凝胶层析分类 葡聚糖凝胶是指由天然高分子 - 葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。葡聚糖凝 胶主要由 Pharmacia Biotech 生产。常见的有两大类, 商品名分别为 Sephadex 和 Sephacryl 。 葡聚糖凝胶中最常见的是 Sephadex 系列,它是葡聚糖与 3- 氯 -1 ,2 环氧丙烷 ( 交 联剂 ) 相互交联而成,交联度由 2 环氧丙烷的百分比控制。 Sephadex 的主要型号 是 G-10 ~ G-200 ,后面的数字是凝胶的吸水率 ( 单位是 mL / g 干胶 ) 乘以 10。如 Sephadex G-50 ,表示吸水率是 5mL/g 干胶。 Sephadex 的亲水性很好,在水中极 易膨胀,不同型号的 Sephadex 的吸水率不同, 它们的孔穴大小和分离范围也不同。 数字越大的, 排阻极限越大, 分离范围也越大。 Sephadex 中排阻极限最大的 G-200 为 8 ×10。 Sephadex 在水溶液、 盐溶液、 碱溶液、 弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的, 可以多次重复使用。 Sephadex 稳定工作的 pH 一般为为 2~10。强酸溶液和氧化剂 会使交联的糖苷键水解断裂,所以要避免 Sephadex 与强酸和氧化剂接触。 Sephadex 在高温下稳定,可以煮沸消毒,在 100 °C 下 40 min 对凝胶的结构和 性能都没有明显的影响。 Sephadex 由于含有羟基基团,故呈弱酸性,这使得它有 可能与分离物中的一些带电基团 ( 尤其是碱性蛋白 ) 发生吸附作用。但一般在离子 强度大于 0.05 的条件下,几乎没有吸附作用。所以在用 Sephadex 进行凝胶层析 实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液, 这样就可以避免 Sephadex 与蛋白发 生吸附,但应注意如果盐浓度过高,会引起凝胶柱床体积发生较大的变化。 Sephadex 有各种颗粒大小 ( 一般有粗、中、细、超细 ) 可以选择,一般粗颗粒流速 快,但分辨率较差 ; 细颗粒流速慢, 但分辨率高。 要根据分离要求来选择颗粒大小。 Sephadex 的机械稳定性相对较差,它不耐压,分辨率高的细颗粒要求流速较慢, 所以不能实现快速而高效的分离。另外, Sephadex G-25 和 G-50 中分别加入羟丙 基基团反应, 形成 LH 型烷基化葡聚糖凝胶, 主要型号为 Sephadex LH-20 和 LH-60 , 适用于以有机溶剂为流动相,分离脂溶性物质,例如胆固醇、脂肪酸激素等。 Seph

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