质粒DNA提取与浓度检测工作.pptVIP

质粒DNA提取与浓度检测工作 3. 材料与试剂 材料:含有质粒pCMV-Myc-T10的大肠杆菌DH5α。 pCMV-Myc是一种哺乳细胞表达载体，它含有一个N端c-Myc 尾，常用于免疫反应的检测和蛋白纯化以及作为诱饵蛋白检测酵母双杂交结果。 Suitable host strains: DH5a, HB101, and other general purpose strains. Selectable marker: plasmid confers resistance to ampicillin (100 mg/ml) to E. coli hosts. E. coli replication origin: pUC Copy number: ~500 Insert EcoR1 Xho1 1.9kb pCMV-Myc-T10 4. 步骤 质粒DNA的提取 碱裂解法 溶液1－GET缓冲液： 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。 溶液2－0.2mol/L NaOH, 1%SDS 溶液3－乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O TE缓冲液或水（+ 20?g/ml RNase ）: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70％乙醇 注意： 用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！！！ 培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小时; 取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100?l溶液1(GET) ，充分混匀放置3-5分钟; 加入200?l新配制的0.2mol/L NaOH+1％SDS（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min; 质粒小量提取的方法（手工提取）： 质粒DNA提取与浓度检测工作 课程基本情况简介/质粒DNA提取 基本技术 核酸 的分离纯化(Isolation and Purification of DNA and RNA)； 电泳技术(Gel Electrophoresis)； 基因重组、亚克隆及表达（Gene Recombination, Subcloning and Expression)； PCR技术 ( Polymerase Chain Reaction)； 分子杂交及互作(Molecular Hybridization and Interaction)； DNA测序技术(DNA Sequencing)； 基因功能的研究技术(Gene Function)； 基因的染色体定位（Localization of Gene to Chromosomes） 生物芯片技术（Bio-Chips or Bioarray) …….. 以完整、常用、重要为原则，经典与先进技术相结合，同时介绍相关知识，尽量让学生在有限的学时内掌握更多的分子生物学技术以及相关的知识。 我们的分子生物学实验课程的设计从整体上可以说是一个完整的大实验，因为自始至终，各实验之间相互连贯，要求学生每一次实验既得到本次实验的结果，同时也为下一次更深入的实验做准备（提供实验材料）。 课程基本情况： 次 序 实 验 名 称 周次 学 时 备注 1 课程基本情况简介/质粒DNA提取 3 6.0 2 质粒DNA酶切鉴定及琼脂糖凝胶电泳 4 5.0 3 聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA 5 6.0 4 DNA回收纯化及重组体的构建 6 6.5 5 大肠杆菌感受态细胞的制备、重组DNA的转化及克隆筛选 7 6.5 6 重组克隆的鉴定 8 7.0 7 植物总RNA的提取与电泳 9 5.0 8 核酸转膜、探针标记 10 5.0 9 核酸杂交 12 4.5 10 综合测验、实验讨论与总结 13 4.0 实验安排与实验报告 注：实验报告分为1－2、3、4 (实验6的设计) 、4－5 、 6、7、8－9、10 (6)重组克隆的鉴定实验的几点说明 手工提取质粒方法将在“实验一”中讲到，“实验六”上课时间将提前到下午1:00； 接种培养将在“重组克隆的鉴定”实验课的前一天的晚上进行（7:30-9:00pm? 9:00-10:20?）； 助博将准备好试管LB培养基，用前别忘了加你需要的抗生素; 提供的酶包括E