DNA提取方法及在古DNA中的应用.docxVIP

DNA提取方法及在古DNA中的应用 我国墓葬、考古遗址中经常发掘出土大量猪、马、牛、羊等动物遗骨遗骸、古尸以及植物残留[1-6]，这些遗存为我们提供了古代动物、植物和人类重要的基因信息。古DNA是古代生物的信息载体，作为分子生物学研究的一个工具，在建立DNA动力学模型、探索环境改变与生物多样性的关系、详述灭绝动物的饮食、验证过去群落结构和基因流动障碍、表现生物两性的特性、推断古代和现代人类传播模式、澄清系统发育关系、阐明进化发育生物学等方面已经得到了广泛的应用[7-11]。古DNA对考古学、古生物学以及人类学科具有深远的影响，对于研究物种的起源与进化具有重要意义。文章阐述了几种提取古DNA的主要方法及原理，并列举了一些应用实例。 1 DNA提取的主要方法 1.1 Chelex-100法 原理：当检材比较少时或者基因分型仅需要少量的DNA时，可用Chelex-100提取方法来提取DNA。Chelex-100由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成，是一种螯合树脂，含有亚氨基二乙酸盐离子，可以整合多价金属离子，且比一般的离子交换剂具有更强的金属离子选择性和较高的结合力，可螯合镁离子、钙离子等核酸必需的金属阳离子，防止DNA降解。在低离子强度、碱性及煮沸的条件下，可使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，且结合其他有可能会影响进一步分析的外源物质。经过离心，除去了Chelex-100颗粒，同时使得与DNA结合在Chelex-100上的物质分离，保证了下一步的PCR反应，DNA分析也不受抑制剂的干扰。 方法：以血液DNA提取为例。取微量血液用约400μl纯水震荡破碎红细胞；13，000r/min离心去上清，收集沉淀；向沉淀中加入200μl5% Chelex-100溶液（使用前要充分振摇），在振荡器上反复振荡，放入56°C保温30min以上；取出后振荡混匀，100℃保温8min，振荡后，13，000r/min离心3min，上清用于PCR扩增，或放4°C保存备用。 应用：Chelex-100法适用于血迹、混合斑、毛根、尸骨等生物检材。整个提取过程只需在一个离心管里进行，大大减少实验中污染的可能性，且操作简便，耗时短，成本低廉。由于使用这种方法提取出来的DNA纯度不太高，且不适合长期保存，所以在实验室科研中该方法应用较少。 1.2 酚仿抽提法 原理：苯酚使蛋白质变性，且抑制DNase的降解，但是苯酚会微溶于水。氯仿不溶于水，且苯酚易溶于氯仿，所以可以有效去除苯酚，而且还可以萃取出其他脂类杂质。异戊醇可以减少蛋白质变性过程中产生气泡，而且还有助于不同溶质相的分离，使离心后上层含有DNA的水相、中间变形蛋白相及下层有机溶剂相保持稳定。所以一般酚仿抽提法首先用苯酚抽提，再用25∶24∶1的苯酚-氯仿-异戊醇抽提，最后为了彻底去除苯酚（苯酚对PCR扩增有强烈的抑制作用），采用24：1的氯仿-异戊醇抽提一次，然后用异丙醇或乙醇沉淀DNA。 方法：先用细胞裂解液和蛋白酶K消化样品，取上清，加入等体积Tris-饱和酚，缓慢颠倒混匀10min后4℃低温*****rpm/min离心10min，再取上清，加入等体积的25∶24∶1的苯酚-氯仿-异戊醇，缓慢颠倒混匀10min后4℃低温*****rpm/min离心10min，再取上清，加入等体积的24：1的氯仿-异戊醇，缓慢颠倒混匀10min后4℃低温*****rpm/min离心10min，加入0.6～1倍体积异丙醇缓慢摇至沉淀出白色的DNA，4℃低温*****rpm/min离心5min，弃上清留下DNA沉淀，加入75%乙醇洗涤DNA沉淀，再次离心去上清洗涤DNA，最后离心取上清，留下DNA沉淀，空气中放置挥发干净乙醇，加入60～100μL水溶解DNA。 應用：苯酚氯仿法可以用来提取各种生物的各种组织细胞的DNA，是提取DNA最常用的方法，方法步骤虽然不一，但这种技术对于高质量DNA提取是十分有效的。但是在提取古DNA过程中，一些色素物质在沉淀DNA时会一起沉淀，这些物质一般都是PCR反应中DNA聚合酶的抑制剂，会影响之后的PCR扩增效率。而且实验过程中需反复萃取，每一步都有DNA的损失，要求实验样品有较高的DNA含量。另外，苯酚、氯仿是有机溶剂，对人体和环境影响较大。因此，现在古代生物样品的DNA提取通常不采用苯酚氯仿法。 1.3 碱裂解法 原理：碱裂解法提取质粒DNA是根据染色体DNA与质粒DNA在变性和复性上的差异来达到分离它们的目的。在pH为12.6的强碱溶液里，染色体DNA的碱基之间的氢键会断裂，使DNA双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的碱基之间的大多数氢键也会断裂，但是超螺旋共价闭合环状的两条互补链是不会完全分离的，当以pH为4