最全的g418筛选稳定表达细胞系总结5.pdfVIP

Q：G418怎么配制？ A：我觉得不能用水配， 因为这样 PH会变化很大， 至少要用 PBS。我是配在 HEPES 溶液中的，具体方法如下： 1g 包装的 G418瓶子中，加入 10ml HEPES溶液，浓 度为 100 mg/ml 完全溶解后， 0.22 um 过滤，－ 20 度保存。 HEPES缓冲液配方如 下： 90 ml 水中， 0.8 g NaCl, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H2O,0.1 g 葡 萄糖， 0.5 g HEPES, 溶解， NaOH调 PH至 7.05, 定容至 100ml。 Good answer: 推荐用 HEPES。特别是当细胞对 G418不敏感， G418使用浓度高时，如果用水、 PBS配置，会极大的改变细胞培养基的 pH值，影响细胞的生长。 1mol/L HEPES 的简单配置： HEPES11.91g ，溶解于 40ml 的 ddH2O，用 10mol/L 的 NaOH调节 pH 至 7.5-8.0 ，定容至 50ml，0.22um 小滤器过滤。 HEPES最终使用浓度 15-20mM。 Q: 我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆， 如果我用很高浓度的 G418 直接加进培养瓶直接筛选，这样做可以吗？我做过 G418杀伤曲线， 300ug\ml 就 基本上可以杀死细胞， 我想直接用 1000ug\ml 来筛选，不知是否可行？会不会有 什么问题？ A: G418筛选要做预试验确定最佳浓度， 将细胞稀释至 1000cell/ml ，每孔 100ul 加入有培养基的 24 孔板，将每孔中的 G418浓度稀释至 0,,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml 等１ 2 个级别 , 培养 10-14 天， 以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般 400- ８００左右，筛选时比该浓度再高 一个级别，维持使用筛选浓度的一半。 G418浓度太高也不好，会对细胞的损伤太大，影响增殖。我用过 Zeocin ，为了 加速筛选，用了最低剂量的两倍浓度， 结果一个阳性克隆都没筛到， 欲速则不达。 Q: 我用 24 孔板做了 G418筛选的浓度梯度，确定最低致死浓度为 600mg/l 。我 现在用这个浓度筛选我转染后的细胞， 我应该保持这个浓度多少天才能确保我筛 选完成呢？在这期间可以换液吗？筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话， 培 养基中是否还应该加一定浓度的 G418？如果要加的话什么浓度比较合适？ A: 应该保持这个浓度 9 天以上，每 3 天换液一次。筛选完了之后存活的细胞再 培养传代的话，培养基中应该加一定浓度的 G418，一般在最低致死浓度的 60% 左右。 Q: 在 6 孔板里进行 NIH3T3细胞转染后的 G418筛选， 2 周后单克隆形成，于是 就挑取单克隆，之前 6 孔板里的细胞很多，用 0.125%typsin+0.25%EDTA消化， 1000 转/ 分离心 10 分钟 ，肉眼可以 看到细胞沉淀， 接种至 25ml 塑料培养瓶中， 镜下看密度可以，但是细胞形态成多态性：少量是圆形，大多数是梭形。第 2 天一看没有细胞贴壁！做了 2 次都这样，请问我的操作步骤有问题吗？ A: 看了你的操作步骤，个人观点认为你挑出来的不能称之为单克隆，在