大肠埃希氏菌O157：H7方法学验证报告.docVIP

PAGE 4 GB4789.36-2016大肠埃希氏菌O157：H7/HM检验方法学验证报告 验证目的 验证《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157：H7/HM检验》在本实验室的适用性。 二、验证方法 样品采样方案依据GB4789.1-2010 《食品微生物学检验 总则》的要求进行，本实验样品取三个不同品牌典型样品进行实验，严格按照GB4789.36-2016进行。 表1:实验方法设计表 样品种类 样品名称 样品编号 实验人员 实验方法 蜜饯制品 xxx xxx a、b 双人双平行 熟肉制品 xxx xxx a、b 双人双平行 即食果蔬制品 xxx xxx a、b 双人双平行 除上述实验程序外，为保证本次验证的科学性和准确性，本次实验添加阴阳性对照，标准菌株大肠埃希氏菌（ATCC25922）做阳性对照，大肠埃希氏菌O157：H7（NCTC12900）做阴性对照，与样品实验程序同时进行。 三、验证设备和试剂 冰箱： SC-322 青岛海尔电器 生化培养箱：SPX-150B-Z 上海博迅实业 电位pH计：PHS-3C+（精确度0.01） 成都世纪方舟科技有限公司 恒温振荡器：SHA-A 江苏金坛环宇科学仪器厂 菌落计数仪：Scan-500 北京五洲东方科技发展有限公司 天平：JE-502 上海浦春计量仪器有限公司 三用紫外分析仪：ZF-2 上海安亭电子仪器厂 培养基和试剂： 改良EC（mEC+n）肉汤 北京陆桥技术股份有限公司 改良山梨醇麦康凯(CT-SMAC)琼脂 北京陆桥技术股份有限公司 三糖铁琼脂 北京陆桥技术股份有限公司 营养琼脂 北京陆桥技术股份有限公司 半固体琼脂 北京陆桥技术股份有限公司 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-MUG（MUG-LST）北京陆桥技术股份有限公司 O157乳胶凝集试剂盒 广东环凯微生物科技有限公司 O157生化鉴定试剂盒 北京陆桥技术股份有限公司 四、验证环境 依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录； 依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、生物安全柜进行清洁消毒灭菌并记录； 依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405-2008》定期对对无菌室及生物安全柜进行沉降菌检测并记录； 无菌室检验：详见《XXXX》； 五、验证步骤 1.操作步骤 1.1增菌 以无菌操作取检样25g (或25mL)加入到含有225mLmEC+n肉汤的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min~2 min； 36℃±1℃ 培养18h~24h。 1. 2分离 取增菌后的mEC+n肉汤，划线接种于CT-SMAC平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上，36℃±1℃培养18h~24h，观察菌落形态。在CT-SMAC平板上，典型菌落为圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色;在大肠埃希氏O157显色琼脂平板上的菌落特征按产品说明书进行判定。 1. 3初步生化试验 在 CT-SMAC 和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上分别挑取5个~10个可疑菌落，分别接种TSI 琼脂，同时接种MUG-LST肉汤，并用大肠埃希氏菌株( ATCC25922 或等效标准菌株)做阳性对照和大肠埃希氏菌O157 : H7 ( NCTC12900 或等效标准菌株)做阴性对照，于36℃±1℃培养18h~24h。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在TSI琼脂中，典型菌株为斜面与底层均呈黄色，产气或不产气，不产生硫化氢( H 2 S )。置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察，MUG阳性的大肠埃希氏菌株应有荧光产生，MUG阴性的应无荧光产生,大肠埃希氏菌O157 :H7 / NM 为 MUG 试验阴性，无荧光。挑取可疑菌落，在营养琼脂平板上分纯，于36℃±1℃培养18h~24h，并进行下列鉴定。 1. 4鉴定 1. 4. 1血清学试验 在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落，用O157乳胶凝集试剂作玻