荧光免疫试验.pptxVIP

掌握：荧光的基本知识；荧光抗体染色与结果判断。 熟悉：荧光物质。 了解：荧光抗体的制备；荧光显微镜的基本结构；荧光免疫分析；荧光免疫技术的应用。;第一节 荧光免疫试验的组成因素 第二节 间接免疫荧光试验 第三节 流式荧光免疫试验 第四节 其他与荧光检测相关的免疫试验 第五节 荧光免疫试验的临床应用 第六节 影响荧光免疫试验的主要因素 ;荧光免疫试验（fluoroimmunoassay): 以荧光物质标记抗体和抗原，通过与相应抗原或抗体发生特异性结合反应，以此对待测物进行定位、定性和定量分析的检测技术，具有高度特异性、敏感性和直观性，是最早出现的免疫标记技术。; 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。 ;荧光特点： 1 可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光； 2 一旦停止供能，荧光随之瞬间消失；;(一)荧光的基本知识 1.发射光谱:指固定激发光波长，在不同波长下记录到的标本发射荧光的谱图。 2.激发光谱:指固定检测发射光波长，用不同波长的激发光照射标品得到的荧光的谱图。 ;;定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。 各种荧光物质的荧光寿命不同。 ;5.荧光淬灭:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。 如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等 。;如何避免： 勿长时间照射 　　　 脉冲瞬间照射 　　 避光保存;荧光物质;荧光显微镜;隔热滤光片： 位于灯室聚光器前， 作用阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片： 位于光源和物镜之间， 作用能选择性地透过紫外线可 见波长的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片： 位于物镜和目镜之间， 作用阻断激发光而使发射的荧 光透过，保护眼睛。;透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。 落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。;;;1、抗体要求;有能与蛋白质形成共价健的化学基团 荧光效率高， 荧光色泽??背景组织的色泽对比度高。 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有性质。 标记方法简单、安全无毒。 与蛋白质的结合物稳定，易于保存。;;;;间接法： 优点：敏感度高于直接法 制备一种荧光抗体可检测多种抗原 既可用于检测抗原，也可检测抗体 缺点：易出现非特异性荧光 方法较麻烦 操作时间较长 应用：自身抗体的检测; 标本片上滴加特异性抗体 37℃30min PBS洗涤 滴加二抗 37℃30min PBS洗涤 镜检;; -：无或仅见极微弱荧光。 +：荧光较弱但清楚可见。 ++ ：荧光明亮。 +++：耀眼强荧光。 特异荧光强度+以上判定为阳性，对照光应呈-或±。 根据+的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。 ;; 第四节 其他与荧光检测相关的免疫试验;其他荧光免疫试验;自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光 ;2.stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差。 stokes位移小，相互干扰，影响结果准确性。 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱和发射光谱不重叠;发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高;4.荧光标记物的相对比活性 比活性 ：单位时间内每个标记分子 可被探测到的信号量。 Eu3+螯合物 反复激发 1000次/秒 大大提高了荧光标记物比活性;结合β-二酮体;（二）标记物和标记方法;（三）方法类型;（三）方法类型;灵敏度高：最小检出量10-18mol/L 分析范围宽：4～5个数量级 标记物稳定：有效使用期长 测量快速，易自动化 易受污染，本底增高;光线通过偏振滤光片后，形成一个方向的平面光称为偏振光。; 抗原抗体竞争反应 AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱 AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强 若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱 待检抗原含量与偏振荧光强度成反比;方法评价 ;第五节 荧光免疫试验的临床应用;1.血清中自身抗体检测;2.各种微生物的快速检查和鉴定;;（一）时间分辨荧光免疫试验;;荧光素-抗体结合物的结合比率： F/P= ;荧光素与蛋白质结合的比率（F/P） -----