RedET同源重组技术概述.pptxVIP

Red/ET同源重组技术; 内 容 一、 什么是Red/ET同源重组 二、 技术的特点 三、 作用机制 四、 功能元件 五、操作流程及关键因素 六、在基因工程中的主要应用 七、 新技术的发展 八、在其他细菌中的应用 ; 遗 传 重 组;? 重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）;一、 什么是Red/ET同源重组;3. 特点： Red同源重组技术具有同源序列短(15～50bp)、重组效率高、操作简单、快速的特点。 4. 应用 这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行,大大推动功能基因组研究的发展。;g b a;Reda(RecE);RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异 ;RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异 ;Red同源重组技术相关文献;Nature Genetics (1998);1. 不依赖RecA蛋白，在重组酶系统（Redα/Redβ或RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（15~50bp）的供体DNA分子能直接重组到受体DNA分子上，实现替换、插入、删除、突变等； 2. 不受靶标DNA分子大小的限制； 3. 不受内切酶切位点的限制； 4. 精确性：不依赖RecA蛋白，减少了引入非预期的突变、 缺失、替换等的几率； 5. 简便快捷：省去了中间质粒的构建，减少实验步骤、缩短实验周期。;三、 Red/ET重组的作用机制;Red/ET同源重组链退火模型;四、 Red/ET重组中的功能元件;2. RecE和RecT;五、 Red/ET重组操作流程;1. 设计合成引物;引物设计方法;同源臂长度对Red/ET重组效率的影响（数据来自Zhang et al. 1998） ;2. 线性供体dsDNA底物的制备; 线性化载体可以通过酶切或PCR扩增两种方法获得。 1）酶切 选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可,质粒的线性化不彻底，将导致阴性克隆的产生，为了提高阳性率，建议通过双酶切进行质粒线性化。 2）PCR扩增 选取合适的位点，设计正向和反向引物，引物长度一般在18-20bp左右，建议用高保真的聚合酶扩增。为了避免模板质粒DNA对后续试验的影响，建议用Dpn I内切酶消化PCR产物，降低背景，提高阳性率。 不管采取哪种方法，最终线性化载体的浓度需50ng/ul，高浓度的载体有利于提高效率。 ;4. 同源重组反应;5.重组产物转化至感受态细胞;6. 重组子筛选;常用抗生素的工作浓度;7. 重组子的检测;卡那霉素抗性基因（Kan）替换pUC19中的氨苄抗性基因（Amp）;六、 Red/ET重组技术的主要应用;1. 重组质粒的构建 ;步骤1： 酶切目的片段;;插入选择标记;E. coli染色体上插入抗性基因 ; 传统基因工程技术（A）和Red/ET重组技术（B）修饰E.coli染色体实验步骤比较;（B） 不同复制子能承载外源 DNA片段的大小;Red/ET subcloning;直接克隆 Myxococcus xanthus中的沉默基因簇;七、 Red/ET重组新技术的发展;;cry1Ac的启动子片段和终止子片段“一步”重组入pHT315质粒上 ;2. 四重同源重组（Quadruple recombineering） ;质粒pR6K-GT1-cotc-lacZneo上目的片段（6123bp）插入人类scn10a基因BAC的第一个内含子中 ;3. “双同源臂”策略(Double homology arms strategy)