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双脱氧末端终止法论文 双脱氧末端终止法论文 深圳大学考试答题纸 (以论文、报告等形式考核专用) 二○一三～二○一四 学年度第 一 学期 课程编号 02 课程名称 遗传学发现 姓名 专业年级 主讲教师 王亮 评分 学 号 题目： 双脱氧链终止法的进展及其在现代医学中的应用和意义 【摘要】自1977年,Sanger 双脱氧链终止法为代表的第一代测序技术确立以来，在三十多年里，DNA 测序技术已经取得了重要的进展。测定DNA 的核苷酸序列，对于了解基因及其结构、基因表达、及其表达的调控机制，乃至对于基因改造和分子进化研究等方面，均具有重要的意义。本文就双脱氧链终止法为代表的DNA 测序的进展及其在现代医学中的应用和意义作一简单介绍。 【关键词】双脱氧链终止法，进展，意义 DNA 序列分析是基因工程和分子生物学领域最重要的技术之一, 是了解基因结构和功能的基础。DNA 分子中核苷酸的排列顺序是生物体中最基本的结构, 几乎一切生物遗传信息都编码在DNA 的核苷酸序列之中。DNA 序列快速分析技术的广泛应用, 有力地推动了生物学的迅速发展。七十年代中期Sanger 和Gilbert 的DNA 序列快速分析技术的出现使人们能够深入观察到生物基因结构与调控关系。双脱氧链终止法测序是Sanger 等于1977 年建立起来的。这一方法与同期出现的Maxim －Gilbert 化学降解法，都被认为在DNA 序列测定诸方法中最为快速、简便、准确。尤其是Sanger 双脱氧链终止法测序原理简单，操作容易，能为一般实验室所接受，目前成为世界各实验室测序的主要方法。 二、Sanger 双脱氧链终止法的基本原理 Sanger 的“双脱氧”DNA 序列分析法是在“加，减”法的基础上，经过改进建立的。其基本原理是: 核酸模板在DNA 聚合酶、引物、4种单脱氧核苷三磷酸(dNTP, 其中的一种用放射性P32标记) 存在条件下复制时, 在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸( ddNTP),因为双脱氧核苷没有3′-OH, 所以只要双脱氧核苷掺入链的末端, 该链就停止延长, 若链端掺入单脱氧核苷, 链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3′端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后, 分4个泳道进行凝胶电泳, 分离长短不一的核酸片段, 长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后, 根据片段3′端的双脱氧核苷, 便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。 三、双脱氧链终止法的进展 在Sanger 链终止测序的基础上，逐渐形成了越来越完善的序列测定系统。早期，Messing 等构建了丝状噬菌体M13克隆载体。通过分子克隆技术将目的DNA 到单链线状噬菌体M13载体上，提取单链模板用于序列测定。之后, 人们在DNA 序列分析的基本策略、提高测序的精度及效果等方面进行了不懈的努力。例如,1982 年, 洪国藩建立了“非随机”DNA 序列测定法, 使测序速度明显提高；由于双链DNA 测序省去了M13测序亚克隆的构建这一步骤, 近些年来倍受欢迎；使用碱基类似物dITP 或7-deaza-dGT P 取代dGTP, 减少了凝胶电泳后压缩效应给阅读带来的麻烦；各种DNA 聚合酶的改进, 如人工修饰的T 7DNA 聚合酶( 也称测序酶Sequenase) ；使用S-dATP 标记和缓冲液梯度胶分离, 改善了电泳图谱的可读性, 增加DNA 顺序的可读长度等等。 随着人们对放射性同位素对人体危害的进一步认识, 在许多实验室已经使用非放射性物质取代放射性同位素。利用地高辛和生物素测序是近年来发展的一种测序手段。其酶学部分利用了双脱氧法的原理, 但在测序反应体系中, 以非放射性标记物(如地高辛、生物素) 代替放射性同位素示踪测序反应的产物, 最后通过酶显色反应显示出测序结果。 1987 年美国ABI 公司推出了DNA 序列自动测定仪, 它集合双脱氧法、荧光标记法和激光检测法于一身, 利用检测器与计算机联合完成。这种自动测序仪的原理仍沿用Sanger 等建立的双脱氧链终止法, DNA 聚合酶催化延伸反应产生的DNA 片段仍需通过序列胶电泳分离, 但都采用了无放射性伤害的荧光标记物。ABI 公司的研究人员经长期实践摸索, 最终确定了四种荧光基团分别作为DNA 聚合酶延伸反应中四种ddNTP 终止的DNA 片段的标记物。这种自动测序仪的出现，使DNA 序列分析又得到一次飞跃, 它更简便、更快捷, 使测序的便利性，安全性及获得的通量均大大的提高了。 四、双脱氧链终止法在现代医学中的应用和意义 DNA 序列