医学分子生物学与实验.pdfVIP

1. 简述动物组织蛋白质， DNA ,RNA 提取的大致过程及原理。 答：共同的第一步都是取动物组织进行清洗剪碎，然后用高速组织捣碎机破碎。 DNA 的提取： 通过匀浆、离心得到细胞核组分，然后用 SDS （十二烷基硫酸钠， sodium dodecyl sulfate ）裂解核膜，释放出 DNA- 蛋白质复合物，再 加入高浓度 NaCl ，以增加 DNP 的溶解度，然后加入氯仿 —异戊醇混合液，振荡、乳化，使蛋白质变性， DNP 复合物解离，离心后， DNA 溶于上层水相，蛋白质沉淀夹在水相和有机相之间得以除去，最后用有机溶剂沉淀出 DNA 。 RNA 的提取 : 取组织，剪成小块，在乳钵种研碎，加 20mLSDS- 缓冲盐溶液（见试剂 1. ）使成均浆，倒入磨口具塞锥形瓶内，再加同样体积的含水酚 液，室温下剧烈振荡 10 分钟。置冰浴中分层，在 0-4℃下，以 4000rpmn 离心 15 分钟。吸出上清液，加等体积氯仿－异戊醇，室温下剧烈 振荡 10 分钟，以 4000rpm 离心 5 分钟，或在室温下放置 10 分钟使分层。吸出上清液（若有必要，该操作可反复多次） ，加 2 倍体积 2% 乙 酸钾的乙醇溶液，在冰浴中放置 1 小时使 RNA 沉淀，此沉淀液可在冰箱内较长期存放。若要得到干燥制品，可将沉淀液以 4000rpm 离心 10 分钟，倾去上清液。沉淀用少许 75% 乙醇、 95%乙醇、无水乙醇各洗 1 次，同上法离心，倾去乙醇后，空气干燥。 蛋白质的提取 : 1.组织称重，切小块放入管中。 2.配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（ 1ml 抽提试剂中加入 5 μl蛋白酶抑制剂混合液， 5 μl PMSF和 5ul 磷酸酶混合液） 。 3.加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（ 250mg 组织中加入 1ml 抽提试剂）。 4.用匀浆器每次 30 秒低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴 1 分钟，至组织完全裂解。 5.裂解液于预冷的离心机中 14，000xg 离心 15 分钟。上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。 原理： 在细胞核内， 核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合物，因此在提取和制备 DNA 或 RNA 时，首先必须设法将这两类核蛋白分开。 在不同浓度的盐溶液中， RNP 与 DNP 的溶解度有很大的差别。在低浓度的 NaCl 溶液中， DNP 的溶解度随着 NaCl 浓度的增加而逐渐下降， 当 NaCl 浓度为 0.14mol/L 时， DNP 的溶解度仅为其在纯水中溶解度的 1% ，而当 NaCl 浓度继续增加时， DNP 的溶解度又渐次增大，当 NaCl 浓度增至 0.5 mol/L 时，DNP 的溶解度约与其在纯水中的溶解度近似，当 NaCl 浓度继续增加至 1.0 mol/L 时， DNP 的溶解度约为其 在纯水中的溶解度的两倍，且随着盐浓度的上升，其溶解度仍继续呈增大的趋势。但 RNP 则与之不同，在 0.14 mol/L 的盐溶液中， DNP 溶解度很低，而 RNP 的溶解度仍相当大，因此，通常采用 0.14 mol/L 的盐溶液来除去 RNP，使 DNP 仍保持在沉淀中，然后使用浓盐溶液 （1.7 mol/L 浓度以上的 NaCl）来提取 DNP。 提取出 DNA 或 RNA-蛋白质复合体（ DNP）后，在将其中的蛋白质除去 2. 简述基因工程的原理及过程。 答： 基因工程 （genetic engineering ）又称基因拼接技术和 DNA 重组技术，是以分子 遗传学 为理论基础，以 分子生物学 和 微生物学 的现代 方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的 蓝图 ，在体外构建 杂种 DNA 分子 ，然后导入 活细胞 ，以改变生物原有的遗传特性、获得新 品种、生产新产品。 基因工程 技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。