5、15基因工程上下游技术.pptxVIP

基因工程上、下游技术;;;;一：基因工程技术主要内容 ;1、获得具有遗传信息的目的基因;2 选择基因载体获得重组DNA;3 将重组DNA分子导入宿主细胞;4 鉴定带有目的基因的克隆 ;5 目的基因的扩增及获得目的产物 ;二：基因工程上游技术的主要内容 ;1 聚合酶链反应 ;1.1 PCR技术的基本原理 ;PCR反应主要分为3个部分进行 ;;;1.2 耐热DNA聚合酶 ;Taq DNA poly-merase;Pfu DNA聚合酶;1.3 引物设计 ;;1.4 PCR技术的新进展;1 反向PCR (inverse PCR,IPCR) ;2 反转录PCR(RT-PCR);3 定量PCR;4 DNA单链构象多态性PCR ;5 不对称PCR (asymmetric PCR);6 多??PCR ;7 免疫PCR;2 DNA的序列测定;;2.1 Sanger双脱氧链终止法 ;;2.2 Maxam-Gilbert化学修饰法 ;;2.3 DNA测序技术的若干进展;2.4 DNA自动测序;3 基因文库的构建;3.1 基因组文库 ;基因组文库构建过程 ;3.2 CDNA文库 ;表达型CDNA文库采用表达型载体,插入的CDNA可表达为具有免疫活性或生物活性的融合蛋白,这类库适用于氨基酸序列不完全清楚的蛋白质,不能用核苷酸探针筛选的目的基因,只能采用与表达产物可发生特异结合的抗体或化合物进行标记筛选。 非表达型CDNA文库适用于已知蛋白质氨基酸序列。从而可用核苷酸探针进行杂交筛库的基因 。 ;CDNA基因文库的构建;1 mRNA的分离 ;2 合成CDNA第一链;3 合成CDNA第二链;CDNA的克隆 ;λ噬菌体文库的扩增 ;三：基因工程常用的工具酶;1 核酸限制性内切酶;2 DNA连接酶;3 DNA聚合酶;4 核酸修饰酶 ;;四：基因表达的主要体系 ;1 原核表达体系 ;1.1 大肠杆菌;大肠杆菌质粒载体;1.2 芽孢杆菌 ;1.3 链霉菌 ;2真核生物表达体系 ;2.1 酵母表达体系;2.2 昆虫细胞表达体系;2.3 哺乳动物细胞表达体系;2.3.1 哺乳动物细胞主要载体;五：转基因动物 ;1 发展概况;2 转基因技术;六 转基因植物;第七节 基因工程菌发酵;2、连续培养 将种子接入发酵反应器中,搅拌培养至一定浓度后,开动进料和出料的蠕动泵,以控制一定稀释率进行不间断的培养。 3、透析培养 利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离,通过去除培养液中的代谢产物来解除对生产菌的不利影响。 4、固定化培养 二、基因工程菌的发酵工艺 基因工程菌的发酵工艺与传统的微生物发酵工艺的区别：(1)生物材料方面(2)生产目的方面 1、培养基的影响 常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。;常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。 另外还要加一些无机盐、微量元素、维生素、生物素等。对营养缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。 2、接种量的影响 接种量是指移入的种子液体和培养液体积的比例。接种量小,不利于外源基因的表达,大接种量有利于对基质的利用,缩短生长延迟期,并使生产菌能迅速占领整个培养环境,减少污染机会,但接种量过高又会抑制后期菌体的生长。所以接种量大小取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速度。 3、温度的影响 温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成水平上。 ;在复制水平上,可通过调控复制,改变基因拷贝数,影响基因表达；在转录水平上,可通过影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶,来调控基因表达；温度也可在mRNA复制和翻译水平上影响基因表达,温度还可能通过细胞内小分子调节分子的量而影响基因表达,也可通过影响细胞内ppGpp量调控一系列基因表达。温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。 4、溶解氧的影响 溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数,对菌体的生长和产物的生成影响很大。 外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的O2值。 通常采用调节搅拌转速的方法,可以改善培养过程中的氧供给,提高活菌产量。;5、诱导时机的影响 一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。 6、pH的影响 pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响,所以应根据工程菌的生长和代谢情况,对pH进行适当的调节。 总之,工程菌发酵工艺的优化对异源蛋白的表达关系重大,必须建立最佳化工艺。 三、基因工程菌的培养设备 发酵罐的组成部分有：发酵罐体、保证高传导作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统以及培养液配置及连续操作装置等。;第八节 基因工程药物的分离纯化;一、建立分离纯化工艺的依据 1、含目的产物的起始物料的特点：包括(1)菌种类型及其代谢特