羊膜间充质干细胞原代分离培养标准操作规程.pdf

广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 文件标题 人羊膜间充质干细胞原代分离培养标准操作规程 颁发部门 技术部 文件编码 制定人 审核人 批准人 生效日期 分发部门 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 1 目的 为规范人羊膜来源间充质干细胞原代分离培养的标准操作，特制订本规程。 2 范围 适用于酶消化法分离培养人羊膜来源间充质干细胞的生产工艺流程。 3 职责 技术人员负责实施本规程，质量控制人员负责监督技术人员的实际操作和相关记录。 4 工作程序 4.1 材料 健康胎盘羊膜组织 4.2 仪器设备 超净工作台、倒置显微镜、 CO2 培养箱、电动移液枪、手动移液枪、离心机、 37℃恒温气浴 摇床、 Countstar 计数仪、计时器。 4.3 试剂耗材 4.3.1 试剂 完全培养基（高糖 DMEM 培养基 +10% FBS+1%NEAA ）、1ug/mL EGF 、PBS 缓冲液、 0.5%I 型胶原酶、胰蛋白酶（ 0.25%胰酶 +0.02%EDTA ）、75%酒精、 95%酒精、 0.4%台盼蓝。 4.3.2 耗材 50mL 离心管及离心管架、 15mL 离心管及离心管架、一次性移液管（ 2mL 、10 mL、25 mL ）、 巴氏吸管、 EP 管及 EP 管架、 10cm 培养皿、移液枪头（ 10uL、200uL 、1000uL)、镊罐、酒 棉罐、酒精灯、酒精喷壶、打火机、无菌纱布无菌、 250mL 一次性储液瓶。 4.3.3 器具 4.3.3.1 羊膜制作包 1 （1 个肾形盘， 2 把 18cm 平镊、 2 把 16cm 止血钳、 2 把 16cm 组织镊、 2 把 12.5cm 眼科剪、 2 把 16cm 弯剪、 2 把 16cm 直剪）。 4.3.3.2 羊膜制作包 2 （2 把 18cm平镊、 2 把 16cm 直剪、 2 把 16cm 组织镊） 4.3.3.3 无菌 100ml 烧杯、、无菌 15cm 玻璃培养皿、 无菌粗漏、 无菌 100 目筛网、无菌废液杯、 第 1 页 共 3 页 文件标题 人羊膜间充质干细胞原代分离培养标准操作规程 颁发部门 技术部 文件编码 无菌不锈钢方盘。 4.4 操作步骤 4.4.1 入洁净区之前用抑菌洗手液洗手，用 75%酒精擦拭消毒双手，按照规定穿洁净服、戴口 罩、戴帽子和手套。 4.4.2 开恒温气浴摇床预热，打开超净台紫外灯消毒 30min 。同时将实验所需培养基、 0. 5%I 型胶原酶、胰蛋白酶、 PBS 缓冲液放置室温。 4.4.3 关紫外灯，打开通风 10min，用无菌纱布单向擦拭消毒超净台，点燃酒精灯。所有物品 进入超净工作台前需用 75%酒精消毒。 4.4.4 打开羊膜制作包 1 和羊膜制作包 2 外包装，用 75%乙醇消毒后放进超净台。 PBS 缓冲液、 培养液以及样本用 75%乙醇消毒后放进超净台。 打开装有胎盘的采集盒， 用巴氏吸管吸取 2mL 浸泡胎盘的液体，分装至 2 个 EP 管中， 1mL/管，一份留样，一份送检至质控部。 4.4.5 用 18cm 组织镊或止血钳夹住中间部位用直剪把整个羊膜剪下来放入 15cm 玻璃培养皿 中，用眼科剪剪去血块和损伤较严重的部位，转移羊膜至三个分别装有 PBS 的 15cm 玻璃培 养皿，共漂洗 3-4 次到 PBS 溶液澄清为止。 4.4.6 用直剪将羊膜剪成适度小块（ 6×6 cm2 的面积），分至