实验九聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点.pptxVIP

实验九 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点;一、目的要求;二、原理 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing，简称IEF)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。 ;两性电解质载体(carrier ampholytes) (1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。 (2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。 (3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。 (4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。 ;IEF分离蛋白质并测定pI;图3.6聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3;三、试剂与器材;四、操作方法 1. 凝胶柱的制备 （1）玻璃管的一端插在橡皮帽中(与橡皮接触的部分凝胶不易聚合，可在橡皮帽中先