课题基因敲除小鼠pcr鉴定.docVIP

基因敲除小鼠的 pcr 鉴定 一、技术介绍与研究进展 转 基因、基因敲入 / 敲除动物技术已经 成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术， 该技术从上世 纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历 史，经典技术如 DNA 原核显 微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰， 在小鼠模型建立方面日趋 完善，并且好像剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的 制备技术同样，渐渐从 基础研究实验室转向商业模式， 成为一项高度标准化的新兴产业， 催生了数以百 计的创新药物和成百上千的优异文章。只管如此，传统技术仍 然存在一些难以 战胜的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而 ZFN 和 TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一场面彻底改变。 二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪 80 年代中后期鉴于 DNA 同源重组的原理发展起来的， Capecchi 和 Smithies 在 1987 年根据同源重组（homologous recombination ） 的原理，首次实现了 ES 的外源基因的定点整合（ targeted integration ），这 一技术称为 基因打靶 （ gene targeting ）或 基因敲除 （gene knockout ）， 利用这种 ES 的显微注射便可以制作出基因敲出小鼠（ KO Mice: knockout mice ）;由于这一工作， Capecchi 和 Smithies 于 2007 年与 Evans 分享了诺贝 尔医学奖。 同源重组（ homologous recombination ）定义：是指发生在姐妹染色单体 （ sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的 DNA 分子之间或分 子之内的从头组合。 在基因敲除小鼠制作过程中， 需要针对目的基因两头特异性 片段设计带有相同片段的重 组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重 组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图 1 所示： 图 1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、 制作流程 图 2.基因敲除鼠制作过程示意图 Knockout 载体设计与建立 根据研究项目详细情况和要求把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的 DNA 片段都重组到带有标记基因 (如 neo 基因， TK 基因等 )的载体上，成为重 组的 Knockout 载体。 2. Knockout ES 细胞筛选 Knockout 载体测序考证正确后，将载体线性化，然后电转入 ES 细胞，经过载 体上的正负筛选基因获得阳性的 Knockout ES 克隆。选用 PCR 鉴定打靶载体正 确插入的 ES 基因组 DNA 用于 Southern Blot 鉴定，将 Southern Blot 鉴定的 Knockout ES 扩大培养并液氮保留。 Knockout ES 细胞囊胚注射得到嵌合体小鼠 扩增经鉴定插入或置换片段位置正确的 Knockout ES 细胞，以囊胚显微注射的 方式将一定数量的 Knockout ES 细胞注入特定品系小鼠囊胚中，然后将囊胚移 植到假孕的小鼠子宫中。待后辈小鼠出生后，经过小鼠的毛色中根源于 ES 细胞 毛色的比率判断嵌合程度的高低， 以及该小鼠的后辈中可能获得生殖系传达能力。 由嵌合体小鼠繁殖出生殖遗传系 Knockout 小鼠 将嵌合体小鼠与适合品系的小鼠交配，后辈小鼠出生后，经过 PCR 方式检测小 鼠是否含有打靶序列。如有，则该小鼠为具备生殖遗传能力的 Knockout 小鼠 (F1 代鼠 )。 Knockout 小鼠生殖系传达鉴定 将嵌合体小鼠和适合品系野生型小鼠交配，通事后辈小鼠毛色或 PCR 基因型鉴 定的方法考证嵌合体小鼠生殖系传达能力。 四、 基因敲除常有方法 一、常规基因敲除鼠（ Conventional Knockout ） 常规基因敲除是经过基因打靶， 把需要敲除的基因的几个重要的外显子或许功能 地区用 Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达 该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影 响，而且这个基因没有胚胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（ Conditional Knockout ） 条件性基因敲除小鼠是经过基因打靶，把两个 loxP 位点放到目的基因一个或几 个重要的外显子的两边。该小鼠和表达 Cre 酶小鼠杂交之前，其目的基因表达 完 全正常。当和组织特异性表达 Cre 酶的小鼠进行杂交后，能够在特定的组织 或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（ 1）该基因有胚胎致死性；（ 2 ）用于研究该 基因