实验一CB法提取植物基因组DNA.docxVIP

lOOOOrpm lOOOOrpm离心10分钟。 实验一 CB法提取植物基因组DNA The following text is amended on 12 November 2020. C T A B法提取植物基因组DN 实验目的： 学习从植物组织中（幼叶）提取基因组DNA的基本原理和方法。 实验原理： 釆用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤 其是氧化醜类），其对DXA的抽提产生不利的影响，所以在抽提缓冲液中需加入抗氧化 剂或强还原剂（如蔬基乙臨）以降低这些成类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎， 并减少研磨过程中各种酶类的作用。 CTAB（hexadecyltrimethylauunonium bromide, + 六烷基三甲基，臭化按），是一种阳 离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐的溶液中（＞L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、 多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀（CTAB能溶于乙醇）即可使核酸分离出来。 CTAB溶液在低于15度时会形成沉淀洗出，因此再将其加入冰冷的植物材料中之前必 须预热（65度），且离心温度不要低于15度。 实验步骤： 1、 取幼嫩的植物叶片（3-5g）剪碎液氮硏磨成粉，转入离心管内。加入等体积的 65C预热的DA提取缓冲液置于65C的恒温水浴摇床上l-2h。 2、 加入等体积的氣仿：异戊昨（24： 1）.轻轻上下颠倒5分钟，静置5分钟，之后于 12000rpm离心10分钟。 3、 吸取上层水相，重复步骤2一次。 4、 吸取上层水相，加入预冷2/3体积的异丙醇，轻缓颠倒2分钟并置-20C冰箱内 lOmin,待DXA沉淀后于12000rpm离心收集，收集的DXA于70%乙醇中洗2-3次。将弃去乙 醇风干后的DXA加适量水使其溶解。 5、 待DA完全溶解后加入1-2 U1不含RNAaseA （10mg/ml） , 37C保温lh以除去DNA 中的RNA。 6、 于Eppendorf管中加入ImL氯仿：异戊醇（24： 1）轻轻上下颠倒10分钟后 （转速可调至 （转速可调至4000rpm和lOOOOrpm）、剪刀 7、吸取上层水相并先后加入1/10体积的3M醋酸钠及2倍总体积的预冷的无水乙臨, 接着置于-20C冰箱，10分钟后lOOOOrpm离心10分钟，弃去无水乙醇，加入70%乙醇洗 涤2-3次，风干，最后将DA溶于适量（200-500 u 1） TE中。 8、待DA完全溶解后进行1%琼脂糖凝胶电泳.检查DA的质量并据已知的DNA分子 最标准估计其浓度。调整浓度后的DNA置于-20°C备用。 实验试剂: 1 IM Tris-HCL () Tris溶于800ml无菌水中，加浓HCL调pH到，定容至1L,高压灭菌。 2、 EDTA () 用NMH调pH值到 用NMH调pH值到 （约20g）,定容至1L,高压灭菌。 3、 NaCL \aCL溶于1L无菌水中，高圧灭菌。 4、 10% CTAB溶XaCL200mlTris-HCL50ml 4、 10% CTAB溶 XaCL 200ml Tris-HCL 50ml EDTA 50ml 10%CTAB 100ml Water 100ml 无菌水中，定容至 80ml lOOmL,高压灭菌。 lOgCTAB 溶于 5、DKA提取液 (500ml) 6、氯仿-异戊酔（24:1体积比） 6、 氯仿-异戊酔（24:1体积比） RNAaseA 8、异丙醇9、无水乙醇: 8、 异丙醇 9、 无水乙醇: 10、3M醋酸钠 11、1XTE缓冲液 实验仪器: 液氮罐、离心管、离心管架、恒温水浴摇床、枪及枪头（血1和200ul）、离心机 注意事项 叶片磨得越细越好。 移液器的使用。 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性 外，第一步的操作应迅速.以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNAftS.使DW降 解。