第11章基因工程新技术.pptx

第11章 基因工程新技术;1.λ Red 和 RecET 重组系统及其应用2. 位点特异性重组系统及其应用3. 基因打靶4. 基因抑制技术;早在1990s, 研究者发现在酿酒酵母等真菌中具有高效的同源重组系统，仅需要20~40bp长的同源区即可发生重组。可以方便的利用 PCR产物进行基因打靶或替换。 细菌的同源重组频率较低，且需要较长的同源区段. ; 1998年左右，随着对λ噬菌体重组系统的深入研究，发现该重组系统可以在E.coli中实现高效同源重组，且同源区长度要求极低：约40bp。后来，在Rac噬菌体??发现类似的重组系统。随着该技术的应用，出现了一个新的术语：;λRed/ET recombination systems are highlighted by their ability to cross PCR-generated substrates bearing small regions of homology to the target gene (40–50 bp) into bacterial chromosomes, allowing bacterial geneticists to perform PCR-mediated gene replacement;(1) λ Red 系统 及 rac 噬菌体的 RecET系统的原理;(2) 主要应用;II 结合反向筛选进行基因替换;;III 介导单链DAN重组，进行基因修饰;重大改进：MAGE技术（Multiplex Automated Genome Engineering） ;Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution ;marker;2. 位点特异性重组系统及其应用;两边为13bp反向重复序列，中间位8bp非对称核心序列;（1） 重组机理;当基因组含有一个重组酶识别位点时，转入基因可以发生位点特异性整合，但必须解决整合的稳定性问题;loxp 位点的点突变;（2）主要应用 I 利用位点特异性重组控制转入基因的表达;II 条件缺失突变体的构建;III 利用位点特异性重组进行染色体工程;例：植物中染色体大片段的缺失; 染色体大片段颠倒：两个特异性位点反向排列，重组酶表达后，部分细胞的两个位点之间序列颠倒。;A single chromosomal FRT site becomes the substrate for recombination with FRT-containing replication-deficient plasmids that carries lacZ and lacY, designed in such a way to create either a transcriptional or translational fusion to the promoter of interest.;3.基因打靶及无痕操作技术;I 单交换同源重组法 利用整合性质粒上与染色体DNA同源的区段进行同源重组，通过整合性质粒插入染色体来达到对染色体DNA的复制、失活、启动子替换等目的。 原理图：;构建整合质粒：原启动子+orfA5’端与报告基因的融合片段（转录融合、翻译融合均可） 可以通过报告基因研究原启动子的表达规律，即基因A的表达规律;对于高效短同源重组系统，可用两端有短同源区的PCR产物直接进行基因打靶（见?red系统），省去克隆步骤。 对于长同源区重组系统，无法通过PCR引物引入同源区，需要经过多次克隆构建基因打靶质粒，然后转化质粒进行基因打靶;白喉毒素A基因（DTPA)的负筛选作用：A亚基抑制蛋白合成，不需加筛选药物，从而避免真核细胞的非同源重组整合 neo基因的正筛选作用，对氨基糖苷类抗生素G418的抗性 单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV TK)基因的负筛选作用， 将丙氧鸟苷或非阿尿苷（FIAU）变为毒性物质，在含丙氧鸟苷或FIAU培养基中筛选;III 二次单交换同源重组（属于无痕操作技术）;;也可利用二次单交换同源重组进行等位基因置换 ;IV 其它无痕操作技术;4. 基因抑制技术;（1）反义核酸技术;构建反义基因表达载体，转化入反义基因，持续稳定地抑制基因表达。或者直接将反义核酸片段导入细胞，对基因表达进行短期干扰。 ;反义RNA的抑制效果与RNA二级结构有重要关系。在原核细胞中，反义RNA以针对SD序列效果最好，而在真核细胞中以5‘ 端非编码区为标靶最有效。 主要作用机理有以下几种：; 反义RNA技术的特点 特异性强 操作简便，靶mRNA范围广 安