单克隆分离与挑选.docVIP

The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020 单克隆分离与挑选 单克隆的分离与挑选 在正式开始工作前1-7天时间内准备好：将菌种mm294在LB琼脂培养基的平板上划线，和将mm294 /含氨苄西林抗性基因的菌种在LB琼脂和氨苄西林的培养基的平板上划线。将其在37 oC下培养过夜。培养好后将平板，用封口膜或者塑料膜包起来放置在4℃并干燥的环境中。 实验准备: 2个LB琼脂平板 2个LB氨苄西林的平板 在平板的底部做上清晰的标记，（不要写在盖子上）。 在37℃下预热 材料： 培养的菌和平板 支持和仪器 2个LB琼脂平板 含有10%漂白粉的垃圾袋 2个LB氨苄西林的平板 或者其他的消毒措施 培养好的mm294LB琼脂平板 实验用煤气灯 培养好的mm294/氨苄西林LB氨苄西林的平板 接种环 记号笔 平板划线技术： 在平板上写上你的标记和日期用记号笔，每个平板都预先写上LB琼脂或者LB琼脂+氨苄西林 选择两个LB琼脂平板，一个标记-PAMP(氨苄阴性)细菌不含质粒，另一个标记+PAMP(氨苄阳性)细菌含质粒。 选择两个LB琼脂+氨苄西林平板，一个标记-PAMP(氨苄阴性)细菌不含质粒，另一个标记+PAMP(氨苄阳性)细菌含质粒。 像握铅笔一样握住接种环，在灯上烧接种环，烧到环呈红热状态，然后继续烧下半部分。 放凉5秒，不要把接种环放在试验台上避免被污染。 大肠杆杆菌的一种划板技术 从培养平板开始： a 用另一只手移动培养有E。Coli的平板的盖子，不要将盖子放在试验台上，盖子面朝下对着培养平板，防止污染物落入平板中。 b把接种环在平板干净的地方刺几下使其冷却。 C 用接种环刮取一个可见的菌团作为一个克隆，不要刮烂琼脂层。更换一个新的培养皿盖，按照步骤7进行。 选一个LB-PAMP平板，打开盖子一点一点，只要足够划线就可以。 划线1：划动接种环的前端向琼脂层表面划线。并使划线遍及平板的顶部，避免划烂琼脂层。 划线2：重新烧接种环并使它通过刺入琼脂层变凉，要远离第一次的划线。接种环通过第一次的划线（通过是不要抬起接种环），并画锯状线，使其约占整个平板表面的1/4. 划线3：重新烧接种环并使它通过刺入琼脂层变凉，要远离前两次次的划线。接种环通过第二次的划线（通过是不要抬起接种环），并画锯状线，使其约占整个平板表面的1/4，且锯状线不要再接触到前面划的线。 划线4：重新烧接种环并使它通过刺入琼脂层变凉，要远离前三次的划线。接种环通过第三次的划线（通过是不要抬起接种环），并画锯状线，使其仍然能占到整个平板表面的1/4。 重复4-7的过程，把E.coli接种到平板LB/amp，-PAMP（氨苄阴性）。 重复4-7的过程，把E.coli/PAMP接种到平板LB，+PAMP（氨苄阴性）。 重复4-7的过程，把E.coli/PAMP接种到平板LB/amp，+PAMP（氨苄阴性）。 重新烧接种环，并使它冰凉后放在接种工作台上，最后一次使用要烧接种环，保持这个好习惯。 把平板颠倒放在37℃培养箱中，培养15-20h。（平板倒过来放是为了防止凝结产生的水掉落在琼脂层上引起菌板移动） 选择达到预期效果的单克隆，培养了15-20h。这时单克隆的直径0.5mm-3mm。 14卫生处理 将废弃的菌，消毒处理。