生物化学实验：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）.pptx

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）Sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis一. 实验目的 1.学习SDS测定蛋白质分子量的原理 2.掌握垂直板电泳的操作方法 二. 实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠） 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因素：蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小？SDS的作用SDS is a strong detergent agent used to denature native proteins to unfolded, individual polypeptides. When a protein mixture is heated to 100 °C in presence of SDS, the detergent wraps around the polypeptide backbone. It binds to polypeptides in a constant weight ratio of 1.4 g SDS/g of polypeptide. In this process, the intrinsic charges of polypeptides becomes negligible when compared to the negative charges contributed by SDS. Thus polypeptides after treatment become rod-like structures possessing a uniform charge density, that is same net negative charge per unit length. The electrophoretic mobilities of these proteins will be a linear function of the logarithms of their molecular weights. 当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。符合如下方程式：lg MW =－b ? m + K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m 相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数 因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳Gel15%5%10%200200972006697669766454529294529 Ammonium (AP) (N2H8S2O8; MW: 228.2). APS is a source of free radicals and is often used as an initiator for gel formation.TEMED(N, N, N, N-tetramethylethylenediamine) (C6H16N2; MW: 116.21). TEMED stabilizes free radicals and improves polymerization 垂直板电泳装置加样样品迁移方向电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。大分子混合样品 电泳电泳方向带孔胶 小分子 按分子大小分离 电泳缓冲液 加在槽中的经SDS处理的样品夹在两块玻璃板之间的凝胶电源 电泳缓冲液分子量大分子量小电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。标准蛋白分子量未知蛋白 相对迁移率水平式电泳装置电泳缓冲液凝胶操作过程 1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干2.把玻璃板在灌胶支架上固定好(放好密封条和隔离板) *固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板分离胶(12%)浓缩胶(5%)ddH2O4.3ml2.37ml40%Acr3.0ml0.5mlB