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两步法RT-PCR试剂盒 两步法RT-PCR试剂盒 PAGE / NUMPAGES 两步法RT-PCR试剂盒 两步法 RT-PCR 试剂盒 操作方法 1. 逆转录反响 （ 1） 在无菌薄壁管中加入以下试剂 Total RNA 0.5-1 μg (dN) 9 or oligo(dT) 18 100pmol 2） 混匀后， 70℃变性 5min ，将薄壁管快速置于冰上冷却，而后挨次加入以下试剂： 5×M-MLV Buffer 4μl dNTPs （10mM each ） 1μl RNasin 10U 100mM DTT 2μl M-MLV Reverse Transcriptase 100U DEPC- treated water up to 20 μl 3） 混匀后短暂离心，使用 oligo(dT) 18 引物时在 42℃，使用随机引物 (dN) 9 时在 37 ℃下温育 1 小时。 4） 94 ℃ 5min 停止反响后，冰上冷却。 5） 合成的 cDNA 第一链可直接用于 PCR 扩增或进行其余下游操作。 2. PCR 扩增 （ 1）在 PCR 薄壁管中加入以下试剂 Synthesized cDNA 2-5 μl 10×PCR Buffer 2μl Upper primer 10pmol Lower primer 10pmol dNTPs(10mM each) 0.5 μl Taq DNA Polymerase ddH 2O up to 20 μl （ 2）混匀后短暂离心，而后进行 PCR 扩增。 94℃预变性 2.5min 。进入以下 30~40 个循环（此扩增程序仅供参照） ：94 ℃ 30s ， 60℃ 45s ， 72℃ 1min~3min 。最后 72℃延长 7min 。 注意事项 1、保证 RNA完好性及纯度。 RNA质量是决定合成 cDNA第一链成功的重点要素， 其纯度及完好性可由 OD260/OD280 比值和进行琼脂糖凝胶电泳检测。较纯的 RNA样 品 OD260/OD280 比值往常为 1.8 ~2.0 ，若该比值偏低，应进一步纯化。真核生物 RNA 样品电泳图谱 28s 和 18s 的比值约为 2:1 ，不然，表示有 RNA降解。 2、防止 RNA酶污染。进行 cDNA合成所用的器皿、试剂和溶液一定完好无菌。操作过程一直戴手套以根绝各样 RNA酶的污染。 3、合成 cDNA第一链的引物选择。选择 oligo(dT) 12-18 作为反转录引物，可保证cDNA拥有完好的 3’- 端，往常可获取靠近全长的 cDNA第一链；若选择随机寡核 苷酸 (dN) 6 或(dN) 9 作为引物，引物在整个 mRNA的多个位点退火，产生短的部分长度的 cDNA第一链。这类方法常常用于获取 5’尾端序列及从带有二级构造区 域或带有逆转录酶不可以复制的停止位点的 RNA模板获取 cDNA。 常有问题及参照建议 1、cDNA产量很低，为何？ 可能的原由： (1)RNA 模板质量低； (2) 对 mRNA浓度预计过高； (3) 反响系统中存 在反转录酶克制剂或反转录酶量不足； (4) 反响体积过大，一般不该超出 50μl 。 2、合成不了长链的 cDNA，为何？ （ 1）RNA降解。对使用的用具、试剂用 DEPC、干热或湿热灭菌办理， 以根绝 RNase 污染。同时，在逆转录反响中加入 RNase克制剂。 2）反响条件不适合。经过预实验确立最适合的反响条件，包含酶量、盐浓度、反响温度（ 37~56℃）、 DTT浓度（ 0.5 ~10mM）。 3） RNA构造问题。提升逆转录反响温度，或许使用随机引物。