人外周血淋巴细胞微核实验检测方法（CB 微核法）、原始记录、检测报告.pdfVIP

DB 11/T XXXXX—XXXX 附 录 A （规范性） 人外周血淋巴细胞微核实验检测方法（CB 微核法） A.1 微核检测所需试剂 A.1.1 松胞素-B的配制 将 5 mg 松胞素-B 溶于2.5 mL 二甲基亚砜（DMSO）中，配成终浓度 2 g/L 的储存液，-20℃ 避光冻存。 A.1.1.1 用时将储存液融化，吸取0.3 mL，加入1.7 mL生理盐水中，即为终浓度300 mg/L的工作液。 A.1.1.2 配制过程需避光。 A.1.2 低渗液氯化钾（KCl）的配制 称取氯化钾5.59 g，加入去离子水使其充分溶解，定容到1000 mL，配成0.075 mol/L 氯化钾溶液， 常温保存备用。 A.1.3 固定液的配制 取甲醇、冰乙酸，配成体积比3:1的固定液。固定液需在用前新鲜配制。 A.2 全血培养 A.2.1 外周静脉血采集 体检时静脉血的采集应在所有放射性检查前进行。用肝素抗凝采血管采集受检者静脉血约2 mL。 A.2.2 全血培养步骤 A.2.2.1 在培养用离心管上编号并注明培养开始时间和日期。将采集的静脉血0.6mL～0.8 mL加入到含 5 mL RPMI-1640培养液离心管中，轻轻摇匀，37℃±0.5℃恒温培养箱内培养。 A.2.2.2 培养40 h～44 h后，加入松胞素-B 至终浓度6 mg/L，继续培养到66 h～72 h。 A.3 微核标本制备 A.3.1 低渗 将培养离心管以1000 r/min～1500 r/min (约200 g～250 g)离心8 min～10 min后，取出离心管， 用吸管轻轻吸去上清液，每管加入8 mL经37℃预温的0.075 mol/L KCl，将细胞团块充分吹打混匀。 A.3.2 预固定 低渗完毕，立即每管加入2 mL新配制的固定液，用吸管吹打混匀，以1000 r/min～1500 r/min(约 200 g～250 g)离心8 min～10 min。 A.3.3 第一次固定 8 DB 11/T XXXXX—XXXX 取出离心管，用吸管吸去上清液，每管中加入8 mL 固定液，用吸管快速吹打细胞团块并充分吹打 混匀，常温下固定20 min～30 min，以1000 r/min～1500 r/min(约200～250 g)离心 8 min～10 min。 A.3.4 第二次固定 取出离心管，重复第一次固定的操作。 A.3.5 制片 取出离心管，吸去上清液，根据细胞团块的大小每离心管中留3滴～5滴固定液以调节细胞浓度，混 匀。然后将细胞悬液滴到4℃冰箱预冷的洁净载玻片上，室温空气自然干燥。 A.3.6 编号 对每一张微核标本片进行编号，并按照编号做好记录。 A.3.7 染色 在PH6.8 的磷酸缓冲液配制的10%吉姆萨（Giemsa)染液中染色8 min～10 min，以一定倾角（约 45°)用自来水轻轻冲洗，洗掉染液后置于玻片架上室温下自然晾干。 A.4 阅片 在显微镜（400×）下阅片，根据7.2.4.1 和7.2.5.1 选择双核CB 细胞和微核进行分析。对微核细 胞拍照，并将坐标记到原始记录上。共分析1000 个双核CB 细胞。 A.5 检测结果评价 计算微核细胞率，按本实验室正常值范围进行评价。 9 DB 11/T XXXXX—XXXX 附 录 B （资料性）