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2021年聚合酶链式反应PCR实验报告 2021年聚合酶链式反应PCR实验报告 PAGE / NUMPAGES 2021年聚合酶链式反应PCR实验报告 试验二 聚合酶链式反应（PCR） 试验原理 聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短单链引物, 在体外快速扩增特异DNA片段技术。它应用热稳定聚合酶, 经过双链DNA模板热变性、 引物退火和引物延伸反复循环, DNA片段以指数方法增加了百万倍。从非常微量DNA甚至单个细胞所含有DNA起始, 可产生ug量PCR产物。 器材与试剂 1.器材: 移液器, EP管, 热盖PCR仪, 电泳仪, 量筒, 锥形瓶, 微波炉, 电子天平, 紫外照色仪 2.试剂: 引物, 模板, Taq DNA聚合酶, 原料（dNTPs）, 缓冲液与Mg2+, H2O, 2*PCRmix溶液, DNA染料 试验步骤 PCR反应体系建立 取离心管, 依次加入试剂混匀 1．H2O 12μl 2．模板 1μl 3．引物T7 1μl 4．引物 sp6 1μl 5．2*PCRmix 15μl PCR仪热循环反应 把离心管放入PCR仪中, 由变性--退火--延伸三个基础反应步骤组成 模板DNA变性: 模板DNA经加热至94℃左右一定时间后, 使模板DNA双链或经PCR扩增形成双链DNA解离, 使之成为单链, 方便它与引物结合, 为下轮反应作准备; 模板DNA与引物退火(复性): 模板DNA经加热变性成单链后, 温度降至56℃左右, 引物与模板DNA单链互补序列配对结合; 引物延伸: 经加热至72℃左右DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶作用下, 以dNTP为反应原料, 靶序列为模板, 按碱基互补配对与半保留复制原理, 合成一条新与模板DNA链互补半保留复制链。反复该循环30次, 每次需要2-3分钟。 电泳检测结果 扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中, 电泳结束后, 放到紫外照射仪中进行透射, 电泳明胶显示清楚条带, 以下图所表示 加入为1号样, 出现在500bp左右条带, 而预算结果为扩增出492bp条带, 故试验成功。 讨论 Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大, 浓度过高可降低PCR扩增特?异性浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 变性温度低, 变性时间短, 极有可能出现假阴性;退火温度过低, 可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板结合而降低PCR扩增效率。 EB: 溴化乙锭是一个高度灵敏荧光染色剂, 用于观察琼脂糖中DNA, 可与DNA结合, 用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号。 溴酚蓝: 电泳指示剂, 相当于300bpDNA电泳速度。 100bp DNA MarkerⅠ是由单独PCR扩增产物混合而成, 已含有1xLoading Buffer,能够直接电泳。包含11条双链DNA片断: 100bp、 200bp、 300bp、 400bp、 500bp、 600bp、 700bp、 800bp、 900bp、 1000bp和1500bp。特异性加强500bp。每次上样4～5μL。 模板通常采取50ng-1ug或102--105 拷贝, 浓度过高反而会抑制反应进行。 引物与模板互补程度决定了PCR特异性, 常见0.1—0.5uM, 浓度过高则特异性下降, 会形成引物二聚体影响试验结果。 结果及结论: 经电泳检测到PCR扩增产物中出现500bp左右条带, PCR扩增成功。