基因工程制胰岛素生工版.ppt

用基因工程方法获得胰岛素;胰岛素是由胰岛B细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治疗。胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因子具有高度生物活性，分子量很大，立体结构异常复杂，体外难以人工合成。所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪体中提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪胰岛素B链第30个氨基酸残基不同，长期服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用基因工程方法获得重组人胰岛素进行治疗。;基因工程制胰岛素三种方法;基因工程制胰岛素三种方法;基因工程制胰岛素三种方法;基因工程制胰岛素三种方法;基因工程制胰岛素三种方法;方法一： 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10% - 20%，因此成本高。方法二： 胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率提高，折叠率高。工艺路线依然繁琐。方法三： 需体外折叠。;基因工程获取胰岛素的步骤;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因??段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;一、获取外源目的基因片段;二.表达载体的构建;二.表达载体的构建;原因： 1.T7噬菌体启动子、核糖体结合位点等引导目的基因高效转录和翻译。 2.乳糖操纵子和乳糖阻遏序列存在的意义主要在于，当目的蛋白对大肠杆菌有毒性的时候，可以通过添加阻遏物，控制目的蛋白以较低水平表达。 3.His6标签序列、凝血酶切割位点存在的意义主要在于方便利用针对His6的整合层析分离纯化蛋白、然后利用凝血酶去除切割标签蛋白。 4.卡那霉素抗性基因编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。 ;三.重组目的DNA片段和表达载体;四、选择与获取表达细胞;四、选择与获取表达细胞;四、选择与获取表达细胞;2、大肠杆菌的培养 （1）LB（Luria-Bertain)液体培养基配制 精解蛋白胨(bacto-tryptone)1.0% 酵母浸出粉(bacto-extract)0.5% 氯化钠1.0% 搅拌使之完全溶解，用5molNaOH(about0.2ml/1000ml培养基）调pH至7.0，如用进口试剂可不必调， 高压灭菌20min(120℃ 0.1Mpa) ;四、选择与获取表达细胞;四、选择与获取表达细胞;四、选择与获取表达细胞;四、选择与获取表达细胞;四、选择与获取表达细胞;四、选择与获取表达细胞;五、重组DNA导入表达细胞;氯化钙法转化的原理机制： 在0 ℃的CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀， Ca2+ 使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中部分核酸酶解离，诱导形成感受态。 此外，Ca 2+ 能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；42 ℃热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙。 ;氯化钙转化法要点： 1. 氯化钙（二价钙离子）的作用：提高细胞壁（膜）的通透性； 2. 热激后迅速转移到冰上：促使质粒DNA转移进入胞内； 3. 这种转化方法适用于双链环状DNA（质粒），线型DNA不能采用此法。（在自然界自然发生的转化过程中，进入细菌细胞中的为单链DNA。）;标准质粒DNA、重组质粒DNA、大肠杆菌JM109、离心机、0.1mol/L CaCl2 、LB培养基、微量移液器、微量离心管、抗生素、20mmol/L MgSO4、微孔滤膜及滤器、培养皿、三角瓶、恒温水浴箱 、恒温摇床 、超净工作台 、玻璃涂布棒、95% 乙醇 ;注意事项： ①质粒的质量和浓度。用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋DNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的