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WesternBlot实验实用技术手册总结 WesternBlot实验实用技术手册总结 PAGE / NUMPAGES WesternBlot实验实用技术手册总结 Western Blot 实验技术手册 Western Blot 是经过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白依据分子量大小分开，而后转移到固相 载体（杂交膜） 上，而后经过抗原抗体反响检测杂交膜上的靶蛋白能否存在， 进而检测到靶蛋白在待检测样本中的表达状况。 当前 Western Blot 已经是蛋白检测的最常用和成熟的技术之一 . 一、 Western Blot 基本操作流程图 细胞 / 组织蛋白提取 ↓ 蛋白定量 、蛋白变性 上样 、电泳 ↓ 一转膜 ↓ 关闭 ↓ 孵育一抗 ↓洗膜 孵育二抗 ↓洗膜 底物孵育 ↓ 曝光或显色 . Western Blot 操作步骤 1.蛋白提取 、 办理 蛋白提取的质量直接决定着 WB 结果的利害，所以，依据样本种类和检测种类选择合 适的蛋白制备方法是至关重要的。 使用适合的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或许组织样 品. 关于贴壁培育的细胞， 经预冷的 PBS 漂洗 2 次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶克制剂， 而后吸净 PBS，加入预冷的裂解液， 最后用细胞刮子刮取贴壁细胞， 将细胞及裂解液平和地 转移至预冷的微量离心管中， 4℃离心 12,000 rpm ，20 min（根椐细胞种类不一样调整离心力） ， 轻轻汲取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃积淀 . 关于组织样品， 用灭菌的预冷的工具分别目的组织， 尽量置于冰上以防蛋白酶水解， 将 组织块放在圆底的微量离心管或 Eppendorf 管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长久 可保留于 -80 °C，每约 5 mg 加入约 300 μl预冷的裂解液 lysis buffer ，冰浴匀浆后置于 4℃摇 动 2 小时，裂解液体积与组织样本量有适合比率， （最后的蛋白浓度起码达到 0.1 mg/ml, 理 想的蛋白浓度应为 1-5 mg/ml). ，4℃离心 12,000 rpm ， 20 min ，轻轻汲取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃积淀 提取蛋白后进行蛋白的定量，蛋白的迅速定量方法主要蛋白自己的发色基团，或许与其 他显色剂反响产生的紫外汲取来进行定量 .当前常用的主要有直接紫外汲取法， Bradford 法、 和 Lorry 法或 BCA 法，一般介绍用 BCA 法 . BCA 测定方法以下 : A ． 酶标板操作 标准曲线的绘制：取一块酶标板，依据下表加入试剂 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 蛋白标准溶液（ μL） 0 1 2 4 8 12 16 20 去离子水（ μL） 20 19 18 16 12 8 4 0 对应蛋白含量（ μg） 0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 2、依据样品数目，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B（ 50:1）配制适当 BCA 工 作液，充足混匀； 3、各孔加入 200 μ L BCA工作液； 4、把酶标板放在振荡器上振荡 30sec，37℃搁置 30 分钟，而后在 562nm 下比色测定。以蛋 白含量（ μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线； 5、稀释待测样品至适合浓度，使样品稀释液整体积为 20μL，加入 BCA 工作液 200 μL，充 分混匀， 37℃搁置 30 分钟后，以标准曲线 0 号管做参比，在 562nm 波长下比色，记录 吸光值； 6、依据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（ μg），除以样品稀释 液整体积（ 20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实质浓度（单位： μg/ul）。 三、样品办理 一般的抗体只好辨别抗原蛋白中的部份序列构造（表位） ，所以，为使抗体能够达到结 合该表位而需要将蛋白样本进行变性， 使之翻开折叠的空间构造， 蛋白变性一般使用含阳离 子变性去污剂如 SDS 的上样 buffer （ loading buffer ），并于 95-100°C 煮沸 5 分钟，关于 多次跨膜蛋白，能够于 70°C 加热 5-10 分钟，标准的上样 buffer 称为 2X Laemmli buffer ， 上样时与样本混淆后变性上样即可， 为了减少样品的稀释比率， 也可制备 4X或 6X 的上样 缓冲液，假如上样 buffer 称为 2X Laemmli buffer ，上样时与样本 1：1 混淆后变性上样即可 . SDS 的阴离子围绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不一样，联合的 SDS 数目不一样，所带 负电荷也不一样，电泳迁徙速度不一样，