实时荧光定量PCR具体实验步骤.docVIP

. .. . .可修编. 实时荧光定量PCR操作步骤 以下实验步骤仅供参考：1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞.室温放置5分钟使其完全溶解。②两相别离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中参加0.2ml的氯仿.盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后.15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相.中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时参加的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA.混匀后15到30℃孵育10分钟后.于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。④RNA清洗 移去上清液.每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中参加至少1ml的75%乙醇〔75%乙醇用DEPCH2O配制〕.清洗RNA沉淀。混匀后.4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA枯燥 小心吸去大局部乙醇溶液.使RNA沉淀在室温空气中枯燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时.先