分析第二讲基因工程制药.pptxVIP

第二讲 基因工程制药;基因工程药物种类;第二讲 基因工程制药;第一节 概述;基因工程技术可十分方便且有效地解决上述提到的问题，显示其在生物技术药物制备上的优势，使得生物药物从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质。 如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程技术获得。;利用基因工程技术生产药品的优点：;利用基因工程技术生产药品的优点：;利用微生物、真核细胞生产基因药物;利用转基因动物生产基因药物;转基因植物生产基因药物;转基因植物基因工程药物的优缺点;第二节 基因工程药物生产的基本过程;获得目的基因;基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段： 上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。 此阶段的工作主要在实验室内完成。 下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。;基因工程药物的上游技术： 1、基因制备技术：制备纯净、高质量的 载体DNA和待克隆的 核酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、连接等分子克隆操作。 2、基因克隆载体:质粒载体 3、重组DNA技术的有关工具酶及其应用 ;基因工程的操作流程;基因制药下游程序;下游阶段在产业化中是极其重要的;第三节基因工程制药基本实验;一、目的基因的获得;获得需要的目的基因常用的方法： （1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(gene library)，从中调用目的基因 （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段 （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等 （4）化学合成法; 聚合酶链式反应（PCR）;PCR反应过程： 第一步：变性（解链） 95 ℃ 第???步：退火 55 ℃ 第三步：延伸 72 ℃ ;二、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶I（或者Klenow大片段）作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。 cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。;1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆 5、将重组体导入宿主细胞 6、cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定;三、化学合成法;四、构建重组质粒和基因克隆;限制性核酸内切酶分类和命名;II型限制性核酸内切酶的基本特性;2、DNA连接酶和DNA分子的体外连接;3、其它工具酶;其它工具酶;其它工具酶;其它工具酶;其它工具酶;其它工具酶;其它工具酶;其它工具酶;其它工具酶;其它工具酶;4、 载体—克隆载体 载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目前最常用的载体包括细菌质粒、噬菌体等。 质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。 基因工程中所用的载体，主要有5类：a、质粒，主要指人工构建的质粒；b、噬菌体的衍生物；c、cosmid；d、单链DNA噬菌体M13；e、动物病毒。 载体的本质是DNA（少数为RNA）;质粒;;（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中拷贝数可高达3000个。 （2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选，且克隆位点位于启动子序列后，以便外源基因表达。 ;表达载体必须具备的条件;表达载体必须具备的条件;表达载体必须具备的条件;质粒DNA制备方法;小量制备;2）染色体DNA的制备 3）真核细胞RNA的制备 DNA的凝胶(Agarose)电泳和 凝胶中DNA的 回收 5) SDS电泳和 凝胶中DNA的 回收;（三） 转化受体细胞和转化子的筛选;第十节 基因工程药物制造示例;Discovery of insulin ;胰島素 (Insulin)與諾貝爾獎;Manufacture of Insulin;Improvement of insu