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HBV cccDNA 检测方法及应用价值的研究进展
【文章编号】 1004-7484 (2014 )05-2942-02
我国是肝炎大国,约有一亿三千万慢性乙肝携带者,由
于慢性乙型肝炎是肝硬化和肝细胞癌的高危因素 [1] ,并且在
我国每年约有 30 万人死于肝硬化和原发性肝癌 [2] 。因此对
于乙型肝炎的诊断、治疗显得尤为重要,但是在治疗过程中
存在着用药疗程、耐药、停药后复发等一系列问题导致肝炎
久治不愈,主要原因之一是由于 HBV 共价闭合环状 DNA
(cccDNA )的存在及消除困难。本文主要对 HBV cccDNA
检测方法及其在临床上应用价值进行阐述。
1 cccDNA 的分子结构
HBV 是嗜肝细胞病毒, 当其感染进入肝细胞后, 在细胞
质脱衣壳并释放松弛环状 DNA (rcDNA ), rcDNA 是两条
链均不闭合, 负链较长的 DNA 分子,随病毒复制进行, rcDNA
进入细胞核,利用宿主细胞胞核中 DNA 聚合酶、拓扑异构
酶等形成 HBV 共价闭合环状脱氧核糖核酸 (covalently closed
circular DNA , cccDNA ),再以 cccDNA 为模板,在 RNA
聚合酶及逆转录酶的作用下合成前基因组 RNA 和 mRNA ,
进一步合成负链 DNA 分子及核心蛋白、脂蛋白等蛋白质,
最后,以负链 DNA 为模板,合成正链 DNA ,正负链组成新
的 rcDNA ,一部分由脂蛋白包绕形成 HBV 病毒颗粒释放,
另一部分变成 cccDNA 来维持胞核内 cccDNA 的水平。 HBV
感染过程如图一所示 [3] :
新合成的 HBV 会感染新的肝细胞重复上述过程,当胞
核中 cccDNA 的含量过高时,直接以 cccDNA 为模板合成
HBV ,使 cccDNA 动态维持在某一水平,在肝内形成了
“cccDNA 池”。可以看出 cccDNA 是 HBV 复制的重要中间
体,且 cccDNA 对常规的抗病毒药具有抵抗作用 [4] ,当抗病
毒药物使血清中 HBV DNA 水平下降后, 肝细胞中的 cccDNA
又会“生产”新的病毒并释放, HBV 又会继续感染肝细胞,
重复感染过程,又使肝内 cccDNA 也得到补充。
由于 cccDNA 的存在且难以清除是导致肝炎久治不愈的
原因之一,所以对于 cccDNA 的检测有其必要性,下面对其
检测方法进行阐述:
2 检测方法
2.1 Southern Blot 方法
最经典的基因分析方法,基本过程包括:将电泳分离后
的 DNA 片段转移到硝酸纤维膜等固相支持物上,用已标记
的探针
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