fz第六章分子生物学基本研究法基因功能研究技术.pptx

第六章 分子生物学基本研究法（下）—基因功能研究技术;基因表达研究技术 基因敲除技术 蛋白质及RNA相互作用技术 基因芯片及数据分析 利用酵母鉴定靶基因功能 其他分子生物学技术; 6.1 基因表达研究技术; 常规SAGE方法（short SAGE）基本流程 连接子1和连接子2的5ˊ端分别加有氨基，以防止5ˊ端相连接。;LongSAGE技术;6. 1. 2 RNA的选择性剪接技术;;一般用RT-PCR法研究一个基因是否存在选择性剪接。选择性剪接使一个基因翻译为多种蛋白质序列。分析人类基因组数据发现60%的基因在表达中可通过选择性剪接产生各种形式的mRNA。;该基因编码一个神经无轴突定向受体，4号外显子有12个变异体，6号外显子有48个变异体，9号外显子有33个变异体，17号外显子有2个变异体。推测该基因共有12×48×33×2=38016剪接异构体。;6. 1. 3 原位杂交技术;RNA原位杂交：一般用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定 的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基 因的表达产物做出定性定量分析。;用组织原位杂交技术检测棉花纤维特异基因的表达;荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH);6. 1. 4 基因定点突变(site-directed mutagenesis);70年代初，Smith等建立了体外寡核苷酸介导的DNA 突变技术，提高了突变效率。;目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点 突变。 重叠延伸介导的定点诱变机制：;图6-7 重叠延伸介导的定点诱变机制 ;;;基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶： 通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有 专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。;基因敲除分为： 完全基因敲除 条件型基因敲除（又称不完全基因敲除） 完全基因敲除：指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性； 条件型基因敲除：指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。 ;关于基因敲除技术，噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统???用最为广泛。;1、完全基因敲除： Neo基因有双重作用：①形成靶位点的插入突变；②作为正向筛选标记。;由于基因转移的同源重组自然发生率极低， 动物的重组概率约为10-2～10-5，植物的概率为10-4～10-5，即使采用双向选择法也很难保证一次就从众多细胞中筛选出真正发生 了同源重组的胚胎干细胞。 所以，得用多种PCR及Southern杂交等多种分子筛选技术验证所获得的确实是目的基因被敲除的细胞系。;2、条件型基因敲除： 完全基因敲除往往导致胚胎死亡；而条件型基因敲除，由于具有可调节性而受到科学家的重视。 特点：常将正向选择标记neor置于内含子中。;6. 2. 2 高等动物基因敲除技术;模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用。;显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方 便。 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。;6. 2. 3 植物基因敲除技术;a.引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物，LB 是指载体上的一段 引物，目的基因片 段(设为900bp)。旁邻序列是经测序后获得的DNA序列。 b，PCR产物电泳结果。分别代表野生 型、杂合子和纯合 子PCR条带。;6. 3 蛋白质及RNA相互作用技术;将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游。 将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（transcription-activating domain, AD） 融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活 Pmin启动子，使报告基因得到表达。;转录因子与顺式作用元件结合，激活最基本启动子Pmin，使报告基因表达。若接入3个以上顺式作用元件，可增强转录因子的识别和结合效率。;图6-16 从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子基本流程示意图。 ;6. 3. 2 酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）;;BD;6. 3. 5 RNAi（RNA interference, RNA干涉）技术及其应用;RNAi作用机制示意图。;研究发现，双链RNA是RNAi的触