蛋白质相互作用精品课件.pptVIP

蛋白质相互作用： 本身具有生物学意义：这样的相互作用在生物体中是起什么作用的 发展技术：利用这样的相互作用创造出一些人为的作用 ;研究蛋白质相互作用的目的是发现并明确其相互作用的生物学意义 蛋白质相互作用是一种表象，通过表象分析规律，是研究蛋白质相互作用的核心 “种瓜得瓜，种豆得豆”是一种表象，反映了遗传这样一种本质 现象 可研究对象 合适的研究方法 ;研究蛋白质相互作用需要微观和宏观的结合;定量分析是研究蛋白质相互作用的基础;定量分析是研究蛋白质相互作用的基础; 研究蛋白质相互作用的意义 1、蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。 2、基因只是决定蛋白质，而蛋白质才是发挥作用的主体。蛋白质的相互作用是发挥其功能的主要活动。;;研究蛋白质相互作用是为了研究相应的生物学功能;从蛋白质相互作用到生物学功能。运用蛋白质直接相互作用，发现相互作用蛋白质，再分析这些作用的生物学意义。 容易犯的错误：研究一大堆的蛋白相互作用，却不知道这些相互作用有什么生物学意义。 从物学功能到蛋白质相互作用。通过改变生物学现象，分析蛋白质间的遗传相互作用，进一步研究相关蛋白质的相互作用。 容易犯的错误：找到了平行变化的不相关蛋白质。;发现蛋白质相互作用 蛋白质-蛋白质直接相互作用 遗传功能分析 序列与结构比较模拟 验证蛋白质相互作用 不同方法的交叉验证 不同生物体系中验证;Protein interaction Affinity: A+B=AB;蛋白质-蛋白质直接相互作用;Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合） Western blot：变性抗原，主要用于检测蛋白质的存在与否。 免疫共沉淀：非变性抗原，用于鉴定不同蛋白质间的相互作用。 免疫共沉淀：Ab－Pr1－Pr2 非特异性结合：Pr1－Ab－Pr2 抗体筛库：cDNA表达库，抗体结合表达的蛋白质，从而得到基因。已经被质谱和PCR所淘汰;Western blot;SDS－PAGE acrylamide的浓度 蛋白质上样的量 相邻泳道的蛋白质量、离子强度和样品体积 转移膜：PVDF膜nitrocellulose膜 抗体;免疫共沉淀 免疫共沉淀：Ab－Pr1－Pr2 非特异性结合：Pr1－Ab－Pr2;免疫共沉淀;蛋白质-蛋白质直接相互作用;Affinity interaction（亲和作用） GST pull down：已知蛋白质和GST融合，与细胞或组织的“蛋白质汤”混合，用谷胱甘肽亲和层析分离和已知蛋白质结合的新蛋白质。GST tag。 Biotin－Avidin结合：Biotin标记已知蛋白质，通过Avidin结合biotin标记的蛋白质，从而得到与biotin 标记蛋白结合的新蛋白质。优点是biotin－avidin的结合是最牢靠的；缺点是细胞内结合biotin的蛋白质很多。 各种不同的tag。许多;GST pull down;GST pull down;;GST Pulldown;Biotin－Avidin结合：生物界最稳定的结合之一;蛋白质-蛋白质直接相互作用;Yeast two-hybrid （酵母双杂交）;lacZ;发现新的相互作用蛋白质;确定蛋白质间相互作用的功能基团;鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用;Two-Hybrid的优点： 是酵母细胞内的in vivo相互作用。 只需要cDNA，简单。 弱的相互作用也能检测到。;Two-Hybrid的缺点： 都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用。 酵母的翻译后修饰不尽相同。尤其是蛋白质的调控性修饰。 自身激活报告基因。 都基因库的要求比较高，单向1/3是in frame 蛋白质毒性。 第三者Z插足介导的相互作用。 假阳性。;;Phage display（噬菌体展示）;Phage display（噬菌体展示） Phage display的最大优点是数量大 细胞：108~109 细菌：1010 Phage：1012 ;蛋白质-蛋白质直接相互作用;SPR is used to monitor interactions occurring in a biospecific surface on a metal layer by measuring changes in the solute concentration at this surface as a result of the interactions. ;2021/8/23;SPR 优点：无标记、实时 Label-free detection SRP does not require any labels or reporter groups to dete