蛋白质的相互作用研究方法.pptxVIP

会计学; 蛋白质－蛋白质相互作用和识别在诸如生物催化、物质转运、信号传导、免疫、细胞调控等多种生命过程起着重要的作用。;第三节 蛋白质的相互作用的研究方法;1. 原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。 优点：生理条件下的结合 缺点???可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用;2.方法 1) 收获培养的细胞（1×107－1×108）冷PBS洗涤2次 2）细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min 3) 12000rpm 离心 30min 4）收集上清并加入适量抗体，4oC摇动1h～过夜 5）加入ProteinA/G-Sepharose(琼脂糖凝胶)悬液， 4oC摇动1h 6）细胞裂解液洗涤ProteinA/G-Sepharose混合液 7）离心弃上清 8）沉淀加2×蛋白Loading Buffer煮沸5－10min 9）离心，上清液跑SDS胶 10）考马氏亮兰染色、银染 Western Blot 质谱分析;3.注意事项 1）细胞裂解 采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白质－蛋