蛋白质等电点的测定精品课件.pptVIP

蛋白质等电点的测定 ;主要内容;蛋白质的解离性质;蛋白质的等电点;最常用的方法是： ①测其溶解度最低时的溶液pH值。 ②等电聚焦电泳测其净电荷为零时的PH ③浊度、分光光度法 ④基于蛋白质与离子交换的作用 ;一、测定溶解度最低时的溶液PH;;实验步骤：; (2) 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1毫升，加一管，摇句一管。此时1、2、3、4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。 ;二、等电聚焦电泳;;三、实验试剂与仪器 1）两性电解质 2）30％丙烯酰胺溶液 3）TEMED 4）10％过硫酸铵溶液 5）负极缓冲液：0.1M NaOH 正极缓冲液：0.1M 磷酸或硫酸 固定液：10％（W/V）三氯乙酸 染色液 脱色液 蛋白质等电点标准 电泳仪 圆盘电泳槽;;四、操作方法 1. 凝胶柱的制备 （1）玻璃管的一端插在橡皮帽中 （2）配胶 表 10mL 7.5%凝胶的配制 试 剂 名 称 体积(mL) 凝胶贮液 2.5 两性电解质载体 0.5 蒸馏水 6.75 10%过硫酸铵 0.05 10%TEMED 0.1 蛋白质混合样品 0.1 混匀后置真空干燥器中抽气 10 min ;（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。 （4）待凝胶聚合 2. 电泳 将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L氢氧化钠溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸缓冲液。连接到电泳仪，接通电源，调电压至160 V，聚焦过夜，至电流降为0，则可关闭电源。 ;3．剥胶 电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在凝胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出。 4 .固定染色 取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定20min?2后，倒掉??定液后用脱色液漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端的距离。 ;5 .蛋白质条带聚焦位置的计算 求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为： 蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离? 固定染色前凝胶条长度 固定染色后凝胶条长度 ;三、浊度、分光光度法;2021/8/23;2021/8/23;9、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。*** 10、低头要有勇气，抬头要有低气。**** 11、人总是珍惜为得到。***** 12、人乱于心，不宽余请。**** 13、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。***** 14、抱最大的希望，作最大的努力。**** 15、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。。***** 16、业余生活要有意义，不要越轨。*** 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。****