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前向角散射光 ——FSC Forward Angle Light Scatter FALS Sensor Laser 侧向角散射光——SSC Side Scatter FALS Sensor 90LS Sensor Laser 散射光 散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异 - 通常使用“散点图”来看散射光信号 - 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据 散点图——Dot Plot lysed whole blood 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。 淋巴细胞 单核细胞 中性粒细胞 光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 线性放大器和对数放大器 （3）荧光测量 荧光信号 荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为 振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子 荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强 荧光检测器 Fluorescence FALS Sensor Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.) 主要由计算机及其软件组成 3. 电子系统 4. 细胞分选系统 Fluorescence Activated Cell Sorting 488 nm laser + - Charged Plates Single cells sorted into test tubes FALS Sensor Fluorescence detector 第三节流式细胞术数据显示 FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少 参 数 单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析 直分析方图 设门分析:REGION和GATE设置 数据显示方式 双参数直方图点图 绿色荧光强度 红色荧光强度 便于数据统计 不同的细胞群可以用不同的颜色标记 主要表达方式 第四节流式细胞样品制备 标本来源： 外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他实验的不同，选用不同的抗凝剂。 EDTA： 2mg/ml 枸椽酸钠：0.38% 肝素：15IU/ml 可选的抗凝剂有： 标本处理时间： 新鲜样本分析时，样本采集后应立即分析 样本固定方法： 1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分钟。 注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。 第五节流式细胞荧光标记 选择合适的荧光染料 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 caspse-3蛋白酶，凋亡中重要酶 * TMP:TMP（Trans - Membrane Pressure Drop），膜设备运行参数。 　　跨膜压差被定义为驱动水透过膜所需的压力，为进水压力和过滤压力的差值。孔径较小的膜所需的跨膜压差也较大，在水温较低、通量较高以及发生污染时，跨膜压差也较高。 DiI, DiO, DiD和DiR均为亲脂性羰花青类荧光染料, 可标记细胞膜和其它疏水组织。这些染料在水中为弱荧光, 而当掺入细胞膜或与蛋白质等亲水性生物分子结合后荧光会显著增强; DiIC6(3)为绿色荧光膜染料, 主要用于检测活细胞的线粒体膜电位, 也用于对细胞凋亡途径进行多参数流式分析。 * 磷酯再分布 annexin:膜联蛋白5（被ca离子活化），凋亡早期 磷脂酰丝氨酸外翻（pS）与Annexin5结合 * 丙酸盐（PI，碘化丙啶，DNA） 右下是早凋，左下是正常细胞。右上是晚凋，左上是坏死细胞 * 磷酸化组蛋白H3（蛋白修饰，成熟） * 流 式 细 胞 术 郭素娟 生殖生物学实验室 2018.6.8 第一节  流式细胞术概述 流式细胞术 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。 细胞不被破坏，测量快速、大