基因工程探索性综合性实验一　龙须菜中半乳糖1磷酸尿苷酰转.pptxVIP

《基因工程》探索性综合性实验一;背景情况介绍 Division:  RhodophytaClass : RhodophyceaeSub-class: Florideae Order: Gigartinales Family : Gracilariaceae;;TGTAGCCAAAGCTGTGCGTGGAAAATGTCGCGTTGTCTGCTTCTCCCCGAAGCTCAACCTAACTGTCGCTGAAATGGCCGTCAAGGAGATCAAGGCCGTTGTTGATGCCTGGGTTGAGGAGTATGACACCCTCTCCAAGCTCGATTACATCGGCCACGTGCAGATCTTCGAGAACAAGGGACAGATGATGGGATGCTCCAACCCTCATCCTCACGGTCAGATCTGGGCATCTGAGTTCGTTCCAGAAGAGCCGCGCATCGCACTCGCCAATCTCAAAGCCTATCACACTAAGAAGGGAACCCACATGTTGGAGGACTACGTCAAACTCGAAATGGAAGCAAAGGAACGTATCGTATGTCAGAAT;实验过程要求 ;实验原理;Southern Blot 原理 ;;探针标记（Random） ;实验材料和试剂（/组） ;实验步骤 ;2、取5?l 龙须菜总DNA制品加1/10体积载样缓冲液做电泳检测，并加5?l分子量对照，目测定量。 3、用3~4种（每组选择一种）限制性内切酶酶切 5?g/种，一般20?l酶切体系/1?gDNA （见说明书）, 等量放大。完全酶切过夜后于80v 1.0%琼脂糖凝胶电泳1h，并加5?l分子量对照。记录Marker各条带及样品位置，做Southern转迹。 4、探针的制备和标记 对提取的含目的基因的质粒，按试剂盒说明标记探针及检测标记率，按试剂盒操作说明P13表准备标记探针和对照，管2~9各1?l 点于膜上，膜自然晾干，80℃烘烤2h，进行显色操作。探针稀释到终浓度10ng/?l。 ;5、Southern Blot： 将凝胶放入培养皿中，加入20ml变性液（没过凝胶），摇动变性1h，倾去变性液，用蒸馏水漂洗一次；换中和液20ml，摇动1h，之间更换一次中和液；在电泳槽内加适量转移液20XSSC，中间支架放一滤纸条，滤纸两端浸没在20XSSC中，滤纸与支架间不能有气泡，取出中和的凝胶，点样孔朝下倒扣于滤纸上，用玻璃棒滚动去除胶与滤纸的气泡，剪一张与胶大小相同的NC膜，放在无菌蒸馏水表面，使之自然吸水下沉，将膜转入20XSSC中浸泡5min，将湿润的膜盖在凝胶上面，膜一经与凝胶接触，不可再移动；将两张与膜大小相同的滤纸置2XSSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡，滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸（高8~10cm），吸水纸上压0.5~1 kg重物，转移12h。 ;6、转移后，在膜上做标记，紫外检测凝胶转移效果，膜自然晾干，80℃烘烤2h。 7、膜的预杂交、杂交和显色。 37~42℃预热DigEasyHyb，以1.2ml/12cm2量添加该液，封膜，预杂交30min。探针100℃ 5min变性后迅速置于0℃，倾去预杂交液，以0.42ml/12cm2膜量加新预杂交液，添加10ng变性标记探针，封膜，42℃杂交过夜或68℃ 6h水浴震荡。 杂交完成后倒出杂交液，将膜放入小烧杯中加5ml洗涤液I，rt 洗涤5min，重复一次，倒出洗涤液，加5ml 洗涤液II，68℃洗涤15min，重复一次，取出膜于滤纸上，空气干燥。 ;(以下为显色过程) 膜于小烧杯中加5ml缓冲液I，洗涤1min，倒去缓冲液I，加10ml缓冲液II， rt 放置30min，倒去缓冲液II，家5ml缓冲液I，洗涤30s，取出膜置于培养皿内，以5ml含DigAp结合物的缓冲液I/50cm2膜量（内含DigAp抗体1?l）添加，rt 30min，取出膜置于小烧杯中，加10ml缓冲液I，洗涤15min，重复一次，倒去缓冲液I，加缓冲液III 1.25 ml，放置2 min，（配制显色液）倾去缓冲液III，加5ml显色液，置于暗中静止待显色，显色结束取出膜加3ml缓冲液IV，洗涤 5 min，空气干燥。;实验注意事项： 有毒害物质及其处理 （巯基乙醇、EB、苯酚/氯仿） 设备 （紫外透射仪、离心机） 统筹兼顾、提前设计 实验周期：4~5天 实验报告：实验原理、步骤、结果与讨论、建议。;《基因工程》探索性综合性实验二;分布;;;;根据NCBI数据库登录的红藻基因序列，采用rDNA转录间隔区ITS1和ITS2进行亲源关系的研究。;;SSU rDNA and ITS;