DNA的重组与转座讲义.pptx

第九章 DNA的重组与转座;重组的定义 遗传重组的类型 同源重组的分子机制 重组和酶 位点特异性重组 转座 转座的机制 遗传重组的应用;6.0 重组;6.1 遗传重组的类型;遗传重组的三种类型;同源重组可能发生在两条同源的DNA的任意位点;(3)异常重组;位点专一重组发生在两条特定的序列，两条重组DNA的其他序列则是不同的。;位点专一重组能使二聚体环状DNA分子产生两个单体环状DNA分子;6.2 同源重组的分子机制;;两条同源DNA分子彼此并排对齐，相互配对DNA中两个方向相同的单链在DNA内切酶的作用下,在相同位置上同时切开。在切口处发生链的交换，形成所谓的连接分子（joint molecule），也称Holliday结构（Holliday structure）。 分支点可以发生移动，称为分支迁移（branch migration），分支迁移的结果是在两个DNA分子中形成异源双链区（heteroduplex）。;Synapsed chromatids;Recombination joint;;; 链交换所形成的连接分子必须进行拆分，才能形成两个独立的双链分子。 这需要再产生两个切口。反应结果要看切开的是哪一对链，如果切口发生在当初未切的两条链上，那么原来的4个链就全被切开，就会释放出剪接重组DNA(splice recombinant DNA)分子。;;; 如果切口发生在当初被切的两条链上，连接分子拆分后将形成补丁重组体（patch recombinant）。分开的两个DNA分子除保留了一段异源双链DNA 外，均完整无缺。 因此，连接DNA分子无论如何拆分，所形成的两个独立的DNA分子总有一段异源双链区，但是异源双链区两侧的重组未必同时发生。;;;DNA双链体配对;Holliday模型;旋转显示Holliday接头结构; Holliday模型能够较好解释同源重组现象，但也存在问题。该模型认为进行重组的两个DNA分子在开始时需要在对应链相同位置上发生断裂。DNA分子单链断裂是经常发生的事，但很难设想两个分子何以能在同一位置发生断裂。;6.2.3 Meselson-Radding模型;Holliday模型要求在两个并排对齐的同源DNA分子的对应位点形成单链切口，从而产生游离的单链末端。然而，在Meselson-Radding遗传重组模型中，仅在一个双螺旋上产生单链切口。利用切口处3’-OH合成的新链把原有的链逐步置换出来，使之成为以5’－P为末端的单链区。随后游离的DNA单链侵入??一条DNA双螺旋中，取代它的同源单链并与其互补链配对形成异源双链区，被置换的单链形成D－环（D-loop）。;;但是更多的事实表明，重组是由双链断裂所启动。现在认为，同源重组是减数分裂的原因，而不是减数分裂的结果。DNA分子双链断裂才能与同源分子发生链的交换，藉以将同源染色体分配到子代细胞中去。因此，双链断裂启动重组，也启动了减数分裂。;6.2.4 双链断裂重组模型（model of double-strand breaks recombination） ;在受体中形成双链断裂;6.3 重组和酶;RecA蛋白; 单链取代 (single-strand uptake);在双链体与单链分子之间RecA催化链交换;RecA蛋白介导的DNA链交换模型;RecBCD复合体具有核酸酶，解旋酶和ATPase活性。 在Chi位点产生单链3’游离未端. Chi位点能够改变RecBCD的酶活性。一旦RecBCD识别出Chi序列，RecBCD核酸酶活性便发生变化，其3’→5’外切酶活性受到抑制，5’→3’外切酶活性被激活，由原来优先降解3’末端链，改变为只降解5’末端链。但是它的解旋酶活性未受到影响。 RecBCD酶活性变化的结果是产生3’末端带有Chi位点的ssDNA。;RecBCD核酸酶从一边开始向chi位点前进, 当它前进时,它降解DNA, 在chi位点,它进行核酸内切, 而后失去RecD,并保留解旋酶活性.;;RuvA可识别 Holliday的连接点结构 RuvB是ATPase，可发动迁移反应 RuvC是一种内切酶， 可特异识别Holliday分枝， 它在体外可切这个连接体，解离重组中间体。;RuvAB是个不对称的复合体，它推进Holliday结合点的分叉迁移;损伤DNA的复制产生间隙;6. 4 位点特异性重组;6. 4 位点特异性重组;位点专一性重组的核苷酸序列;通过在attB和attP之间的相互重组，噬菌体环状DNA转变成线性的前噬菌体；而通过在attL和attR之间的相互重组，前噬菌体能被外切出来。;λ-DNA对E.coli的整合： POP’ + BOB’ →BOP’—POB’ 需要整合酶(Int—拓扑异构酶活性)和整合