胞内游离Ca的测定方法.pdfVIP

Pluronic F-127 (F127) 美国 Molecular Probes Inc. 产品。 Ultima 型共聚焦激光扫描显微镜为美国 MERIDIAN Instruments Inc 产品。 1. 光源： Ultima 型 50Mw UV,200Mw Visible 2. 激发波长： 351-364nm ，488nm ，514nm 3. 扫描系统： Ultima 为台阶扫描，精度 0.1um 目的：监测细胞胞浆中游离钙的动态变化 原理：正常细胞内游离钙浓度 [Ca2 ┼ ]i 为 0.1 umol/L, 胞外钙离子浓度为 1.2-1.3mmol/L, 相差达 10000 倍。胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙震荡 (钙 峰或钙波 )在各种生理过程中起重要作用；病理状态下细胞内钙超负荷将造成一 系列代谢紊乱 ,直至细胞坏死或凋亡；钙离子通道阻断剂已广泛应用于临床。显 而易见 ,测定 [Ca2┼]i 在生理学、病理学和药理学等研究工作中均具有重要意义。 Fluo-3/AM 等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯（ AM 酯）的形式导入细 胞，在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸， 与钙离子的结合物在激发光作用下 能产生特异的荧光。荧光信号的强弱随钙离子浓度的变化而变化。 100ug Fluo-3/AM 溶于 100ul DMSO 中，就是 1ug/ul,1mg/ml,1g/L 方法： 1. 预先用二甲基亚砜 (DMSO) 将 Fluo-3/AM 配制为 1mmol/L (1g/L ) 原 液 ,-20oC 避光保存。 F127 用 DMSO 配制成 20% 溶液 (W/V) 。用无血清无酚红培 养液将 Fluo-3/AM 稀释成终浓度为 10umol/L ，并加入 0.1 ％的 Pluronic F-127 备 用。 2.移去培养皿中的原培养液，用 PBS 液冲洗心肌细胞 2 遍，加入 10umol/L 染料液 1ml ，置于 37oC 的 CO2 孵箱里避光温育 30min 。 3.将染色后的心肌细胞用 PBS液冲洗 3 遍，加入 1mlDMEM 液后置于 20 倍光学 显微镜观察区域及层面，用 LSCM 观察 Fluo-3 染色的细胞的某一层面的荧光图 像。 4. 启动 LSCM，选择 488nm 氩离子激光，启动计算机，运行 lasersharp2000 软 件，选择 time-course 程序，设置扫描间隔时间（ 30sec ）、扫描次数（ 300 次）， 开始扫描。 5.将数据输入 excel 进行整理、统计、分析。 一、细胞内游离 Ca2+浓度 ([Ca2+]i) 的测定 按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针 Fura-2/AM 或 Fluo-3/AM 来检测细 2+ 2+ 胞内 [Ca ]i 。Fura-2 的结构类似于四羧酸的 Ca 螯合剂 EGTA ，能以 1：1 的比例 2+ 2+ 特异性地与 Ca 结合，与 EGTA 不同的是 Fura-2 可发出荧光，并且结合 Ca 后 2+ 荧光特性有改变， Fura-2 及其与 Ca 结合后的复合物的最大激发波长分别为 380 2+ 的存在及其浓度。 Fura-2 为一极性很大的酸 nm 和 340 nm，这种变化可指示 C