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大鼠Munc13研究论文 【摘要】目的：研究大鼠胰腺发育不同阶段Munc131基因及蛋白表达的变化及Munc131在胰岛素释放过程中的作用.方法：应用显微分离及提取技术获得大鼠胚胎发育12.5d（E12.5）,E15.5,E18.5,新生大鼠,出生后21d（P21）及成年大鼠胰腺组织；另外，从大鼠胚胎发育15d开始给予孕鼠半量饮食，造成宫内发育迟缓动物模型，提取其新生大鼠胰腺组织.采用RTPCR,RealtimePCR和Westernblot技术确定Munc131的表达情况，并测定不同发育时期血中胰岛素浓度.结果：胰岛素基因从E12.5开始出现，Munc131基因从E15.5开始表达，随着胎龄的增长，二者表达量皆增多.E15.5和E18.5时munc131蛋白表达量较少，以后明显增多.自E18.5即检测到血中胰岛素的存在，随着胚胎的发育，血胰岛素浓度逐渐升高.宫内发育迟缓新生大鼠比正常新生大鼠血胰岛素浓度低，同时Munc131基因及蛋白表达量亦比正常对照组明显减少.结论：Munc131在胰岛素释放过程中的作用，随着胚胎发育期胰岛素分泌的增多表达也增加，宫内发育迟缓新生大鼠胰岛素分泌减少时，Munc131的表达亦减少. 【关键词】Munc131；胰岛素/分泌；胚胎胰腺发育；糖尿病；宫内发育迟缓 0引言 胰岛素在β细胞内合成后，以分泌颗粒的形式贮存在大致密囊泡中，在营养物质（葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等）、神经递质、激素等刺激下，进入血循环，完成其调节体内营养物质代谢，调节生长发育，控制血糖动态平衡的生理作用［1-2］.业已证实，胞吐过程是涉及许多蛋白因子的复杂过程，可溶性N甲基马来酰胺融合蛋白附着蛋白受体(solublenethylmaleimidesensitivefusionproteinattachmentproteinreceptors,SNARE)复合体是胞吐过程所必须的分子构件；Munc，Synaptotagmin，Rab等蛋白家族的不同成员是其重要的调节因子.这些因子在神经递质胞吐中研究得较多，但他们在胰岛素分泌过程中的确切作用及其精细功能如何尚无定论［3-5］.我们运用基因芯片技术，已建立了大鼠不同发育阶段基因表达谱，初步明确了胰岛素释放的完善过程中相关基因的表达情况，在此基础上，我们重点从胰岛素释放关键因子之一Munc131入手，探讨正常及异常胰腺发育情况下Munc131表达的变化，阐述其在胰岛素释放过程中所起的重要作用，以期寻找糖尿病治疗的新靶点. 1材料和方法 1.1材料SD大鼠由南京医科大学实验动物中心提供.18：00将雌雄鼠合笼，次日晨检测有阴栓者定为孕0.5d（E0.5），分别于受精后12.5d(E12.5),15.5d(E15.5),18.5d(E18.5)，经颈椎脱臼处死孕鼠，剖腹取出孕子宫，分离胚胎，取出胰腺（E12.5,E15.5胚胎胰腺需在解剖显微镜下分离），新生鼠出生后，立即与母体分离，迅速取出其胰腺.出生后21d鼠和成年鼠在低温条件下迅速取出胰腺［6］.部分孕鼠于E15开始给予正常卡路里的50%，直至出生，造成宫内发育迟缓动物模型，待新生鼠出生后，立即取出其胰腺.所有标本置液氮中速冻后-70℃冻存备用.分别取E12.5胚胎胰腺100只、E15.5胚胎胰腺30只，E18.5胚胎胰腺10只（来自3只孕鼠）,新生鼠3只（来自3只孕鼠），用RneasyMiniKit（Qiagen公司）抽提并纯化总RNA.总RNA分装后-70℃冻存，用于RTPCR和RealtimePCR. 1.2方法RTPCR和RealtimePCRRTPCR操作过程按试剂盒（日本Toyoko公司）提供常规步骤.目的基因及内参照引物序列如下：G3PDHforward:5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′,reverse:5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′.Insulinforward:5′CCGTCGTGAAGTGGAG3′,reverse:5′CAGTTGGTAGAGGGAGCAG3′.PDX1forward:5′GGTGCCAGAGTTCAGTGCTAA3′,reverse:5′CCAGTCTCGGTTCCATTCG3′.Munc131forward:5′TGTGGAACAAGGGTCTCATCTGG3′.reverse:5′GGCTGCGAAGTCGTGTAGTAAGG－3′.Munc131RealtimePCR探针设计如下：unc13h1fam:CCAAGCCATGACCCACTTTGCCTG，unc13h1fp:CGCTATGGCGTTGAATCCA，unc13h1rp:TGCGTAGTAGGCGTTGATGTTG.分别取E1