一种外周血游离肿瘤DNA的富集方法、试剂盒及其应用发明专利.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 108251502 A (43)申请公布日 2018.07.06 (21)申请号 201711446648.1 (22)申请日 2017.12.27 (71)申请人 深圳华大基因股份有限公司 地址 518083 广东省深圳市盐田区洪安三 街21号华大综合园7栋7层-14层 申请人 广州华大基因医学检验所有限公司　 天津华大医学检验所有限公司　 华大生物科技（武汉）有限公司 (72)发明人 宋炎　刘磊　叶明芝　王晶晶　 刘继龙　谭美华　茅矛　 (74)专利代理机构 深圳鼎合诚知识产权代理有 限公司 44281 代理人 李小焦　彭家恩 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) 权利要求书2页 说明书12页 序列表2页 附图1页 (54)发明名称 一种外周血游离肿瘤DNA的富集方法、试剂 盒及其应用 (57)摘要 本申请公开了一种外周血游离肿瘤DNA的富 集方法、试剂盒及其应用。本申请的富集方法，包 括采用PAP探针对cfDNA文库进行肿瘤DNA片段捕 获，并以PAP探针为引物，以捕获的肿瘤DNA片段 为模板，进行扩增；PAP探针从5’端到3’端由通用 引物序列和特异识别序列组成，特异识别序列3’ 端包括至少30bp的与肿瘤DNA片段杂交互补的序 列，PAP探针3’末端为双脱氧核苷酸。本申请的富 集方法，通过PAP探针对靶标肿瘤DNA片段进行捕 获，并利用PAP探针进行延伸；特异性好，捕获效 率高；保证了富集产物的纯度，为后续的测序提 A 供了保障。本申请的富集方法，为cfDNA的临床检 2 测提供了一种新的游离肿瘤DNA富集方案。 0 5 1 5 2 8 0 1 N C CN 108251502 A 权　利　要　求　书 1/2页 1.一种外周血游离肿瘤DNA的富集方法，其特征在于：包括采用PAP探针对cfDNA文库进 行肿瘤DNA片段捕获，并以PAP探针为引物，以捕获的肿瘤DNA片段为模板，对捕获的肿瘤DNA 片段进行扩增，实现肿瘤DNA的富集； 所述PAP探针从5’端到3’端依序由通用引物序列和特异识别序列两部分组成，所述特 异识别序列的3’端包括至少30bp的与所述肿瘤DNA片段特异性杂交的互补序列，并且，所述 PAP探针的3’末端最后一位碱基为与所述肿瘤DNA片段特异性杂交互补的双脱氧核苷酸。 2.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于：还包括采用通用引物对所述PAP探针 的扩增产物进行第二次扩增，进一步对肿瘤DNA片段进行富集； 所述通用引物包括PAP探针通用引物和cfDNA文库通用引物； 所述PAP探针通用引物为针对PAP探针的通用引物序列设计的引物； 所述cfDNA文库通用引物为cfDNA文库建库时添加接头引入的通用引物。 3.根据权利要求2所述的富集方法，其特征在于：具体包括以下步骤， (1)将所述PAP探针加入到cfDNA文库中，利用PAP探针对肿瘤DNA片段进行杂交捕获； (2)采用磁珠纯化PAP探针的杂交捕获产物； (3)利用焦磷酸解激活聚合酶反应，对步骤(2)的磁珠纯化产物进行扩增，其中，在焦磷 酸解激活聚合酶的作用下，以所述PAP探针为引物，对杂交捕获的肿瘤DNA片段进行特异