沈辰枝状枝孢霉MD中紫杉醇合成相关候选基因A和A的超表达分析.pdfVIP

紫杉醇作为一种高效、广谱的抗癌药物，它在内生真菌中的含量直接决定了该菌株的药用价 值。HPLC 法通常作为检测紫杉醇的基本方法，常用于定量分析紫杉醇含量。可根据保留时间判 断是否含有紫杉醇和紫杉烷类代谢产物[4]。10-去乙酰紫杉醇（10-deacetylpaclitaxel，10-DAP）是 理想的紫杉醇半合成前体，而 7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇（7-Xylosyl-10-deacetylpaclitaxel ，10- DAXP ）可以转化为 10-去乙酰紫杉醇。多烯紫杉醇（Docetaxel ）是紫杉醇的衍生物，通过干扰细 胞有丝分裂和分裂间期细胞功能所必须的微管网络而具有抗肿瘤作用。本章研究我们利用高效液 相色谱技术（HPLC ）对过表达枝霉MD2 菌株 A10182-MD2 、A10251-MD2 所含有的紫杉醇、及 紫杉醇前体巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰巴卡亭Ⅲ、7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇、10-去乙酰紫杉醇、多烯 紫杉醇的含量进行检测，考察这些成分在过表达 MD2 菌株中的含量情况及对照野生型 MD2 菌株 的变化，为后期的实验提供基础。 PDL、PDA 培养基的配方同第三章。 表 4.1 仪器概览 Table4.1Instrumentoverview 仪器名称 生产厂家 安捷伦 1200Series 高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司 KQ-500E 型超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司 Southern 电泳仪 美国 BIO-RAD 公司 METTLERTOLEDO 分析天平 瑞士奥然科技有限公司 SHZ-Ⅲ循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂 RE-52 型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂 干燥箱 上海精宏实验设备有限公司 分子杂交仪 上海乔枫实业有限公司 水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司 成像系统 美国Synoptics公司 QuantStudio5 荧光定量 PCR 赛默飞世尔科技有限公司 赛默飞世尔科技有限公司 Nanodrop2000 （1）购置 所有标准品均购自上海源叶生物科技有限公司；茉莉酸甲酯购自上海金穗生物科技有限公 司；色谱甲醇购自成都市科隆化学品有限公司；色谱乙腈购自赛默飞世尔科技有限公司；甲醇、 氯仿购自国药基团化学试剂有限公司；尼龙膜购自 BIOSHARP、 DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKit （forcolordetectionwithNBT/BCIP） 购自 Roche。 （2）试剂的配置 ① 1.5moL/LNaCl：称取 17.55g 的 NaCl ，用超纯水定容至 200mL。 ②0.5moL/LNaOH ：称取 4g 的 NaOH ，用超纯水定容至 200mL。 ③0.2MHCl ：用量筒量取 16.8mL 的浓盐酸，用 100mL超纯水稀释，待溶液冷却后，用超 纯水定容至 1L。 . ④20×SSC ：称取 175.3gNaCl，88.2g 柠檬酸钠 2H O，800mL 的水溶