实验操作指南亚洲I型口蹄疫抗体检测 液相阻断ELISA（LB-ELISA）试验.doc

PAGE PAGE 1 实验操作指南 一、亚洲 = 1 \* ROMAN I型口蹄疫抗体检测 液相阻断ELISA（LB-ELISA）试验 液相阻断ELISA主要用于检测抗体。应用于两个方面的目的： = 1 \* GB2 ⑴检测FMD病毒感染，广泛用于国际贸易中； = 2 \* GB2 ⑵监测免疫抗体，评价FMD疫苗免疫效力，也就是疫苗免疫动物的抗强毒攻击能力。 1、反应原理 预先滴定好的固定量病毒抗原与被检血清首先在液相中反应，然后将抗原抗体复合物转移到包被了FMD型特异性抗体的ELISA板中，没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原被ELISA板中的抗体捕获，亦与随后加入的豚鼠搞血清中的抗体结合，再通过兔抗豚鼠IgG酶结合物和底物溶液显色。按试验孔呈现的颜色与抗原对照（未加血清）孔呈现颜色相比较判定结果。抗体滴定以能阻断50%病毒抗原的血清稀释度表示。 2、主要试剂与耗材 = 1 \* GB2 ⑴主要试剂 = 1 \* GB3 ①捕获抗体：口蹄疫146S兔抗血清 = 2 \* GB3 ②检测抗体：口蹄疫病毒146S豚鼠抗血清 = 3 \* GB3 ③酶结合物：兔抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物 = 4 \* GB3 ④病毒抗原及病毒对照抗原：用BEI灭活的病毒细胞培养物 = 5 \* GB3 ⑤标准阳性血清和阴性血清 = 6 \* GB3 ⑥底物溶液：邻苯二胺（OPD）/H2O2溶液（具体配制溶化后，再加2片OPD片剂，充分溶解，分装成5 ml或10 ml/瓶，避光-20度保存。用前避光溶化，临用时每10 ml上述溶液加100ul配备的3%的双氧水） = 7 \* GB3 ⑦终止液：1.25mol/LH2SO4 = 8 \* GB3 ⑧缓冲液 包被缓冲液：0.05MNa2CO3/NaHCO3，PH9.6 稀释液：0.05%（V/V）Tween-20加入0.01MPBS，PH7.4（PBST） 豚鼠抗血清稀释液：5%脱脂奶粉-PBST 洗涤液：0.01MPBST，PH7.4 = 2 \* GB2 ⑵主要仪器材料 = 1 \* GB3 ①ELISA板：96孔平底聚苯乙烯ELISA板。 = 2 \* GB3 ②抗原抗体反应板：96孔U形夜工聚丙微量板。 = 3 \* GB3 ③移液器：0.5-20ul，5-40 ul，50-200 ul，200-2000 ul可调节移液器各一把，8道或12道移液器一把，移液槽5-6个，各配套移液枪尖若干。 = 4 \* GB3 ④37℃温箱。 = 5 \* GB3 ⑤酶标仪：492nm波长滤光片。 = 6 \* GB3 ⑥吸水纸巾。 3、操作步骤 = 1 \* GB2 ⑴包被ELISA板：用包被缓冲液稀释兔抗血清至工作浓度，每孔加50 ul。振荡2-3分钟，封板膜封板或湿盆中室温过夜。 = 2 \* GB2 ⑵抗原抗体（对照血清和待检血清）反应 图1. 96孔酶标板定性检测40份样品布局图 （仅用于亚洲 = 1 \* ROMAN I型抗体检测） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 S1 1:28 S1 S9 S9 S17 S17 S25 S25 S33 S33 +1:32 -1:4 S2 1:128 1:64 1:8 S3 1:128 1:128 S4 1:128 1:256 S5 1:128 1:512 病毒抗原对照 S6 1:128 1:1024 S7 1:128 1:2048 S8 1:128 1:4096 A B C D E F G H 图2. 96孔酶标板定量检测10份样品布局图 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 S1 1:8 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 +1:32 -1:4 1:16 1:64 1:8 1:32 1:128 1:64 1:256 1:128 1:512 病毒抗原对照 1:256 1:1024 1:512 1:2048 1:1024 1:4096 A B C D E F G H 图3. 96孔酶标板定量检测20份样品布局图 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 S1 1:32 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 +1:32 -1:4 1:64 1:64 1:8 1:128 1:128 1:256 1:256 1:128 1:512 病毒抗原对照 S11 1:32 1:1024 1:128 1:2048 1:2