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第 二 十 一 章基因诊断与基因治疗Genetic Diagnosis and Gene Therapy基因(gene) 基因是为生物活性产物编码的DNA功能片断，这些产物主要是蛋白质或各种RNA。基因变异致病类型内源基因的变异基因结构突变基因表达异常外源基因的入侵第 一 节基因诊断Gene Diagnosis一、基因诊断的概念和特点 （一）、定义利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 （二）、分类 DNA诊断—以DNA为检测对象的诊断方法。 RNA诊断—以mRNA为检测对象的诊断方法。（三）、特点针对性强特异性高灵敏度高适用性强，诊断范围广二、 基因诊断常用技术方法（一）、核酸分子杂交技术（二）、聚合酶链反应（三）、基因测序（四）、基因芯片（五）、DNA指纹 （一）、核酸分子杂交(molecular hybridization)技术 核酸分子杂交可用以检测样本中是否存在与探针序列互补的同源核酸序列。 核酸探针 是一类具有放射性标记或化学标记的并与目的目的DNA或RNA分子序列互补的寡核苷酸片段。 探针是能够同某种待研究的核酸序列或蛋白多肽链特异结合的任何分子，经标记之后可用来检测目的DNA/RNA 或蛋白质分子。 实验流程：提取DNA→(限制酶切)→凝胶电泳→膜转移→杂交→放射自显影→分析建立在核酸杂交技术基础上的常用基因诊断方法1、限制性内切酶(restriction endonuclease)酶谱分析法2、DNA限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析法 3、等位基因特异寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO)探针杂交法1、限制性内切酶酶谱分析法 是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异的一种方法。5′3′镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)5′3′正常基因1.15kbA→T ×突变基因1.35kb﹣+镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析1.35kb1.15kb0.2kb正常人突变携带着患者2、DNA-RFLP分析法 中性突变是指在人基因组中，平均每200对碱基可发生一对变异的现象。 DNA多态性是指中性突变导致个体间核苷酸序列的差异。 限制性片段长度多态性是指DNA多态性若发生在限制性内切酶识别位点上，酶切水解该DNA片段就会产生长度不同的片段。RFLP分析法3、ASO杂交法 根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成相应于正常和突变基因碱基序列的两种寡核苷酸探针，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交来检测是否存在等位基因突变。 ﹣+ASO杂交法探针：M N M N M N M N 正常基因 纯合突变 杂合突变 基因缺陷 （新的突变类型？） （二）、聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) 是利用特异的引物，特异地扩增目的DNA的方法。 实验流程：提取DNA→PCR→凝胶电泳→显色→分析Cycle 15?5?5?5?5?5?Cycle 2 5? 5? 5? 5?5?5?1、基本工作原理Template DNAPrimer 15? 5?5?Primer 2 5?5?5?5?5?5?5?5?5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5?5?25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。Cycle 32、常用的PCR方法： 常规PCR、巢式PCR、多重PCR、多种PCR、不对称PCR、反转录PCR、定量反转录PCR、mRNA差异显示PCR、原位PCR、实时PCR等等。3、在PCR技术基础上的常用基因诊断方法PCR-SSCP法*PCR-ASO法PCR-RFLP法PCR-限制酶谱法PCR-STR（短串联重复序列，short tandem repeat）单链构象多态性 (single strand conformation polymorphism, SSCP) SSCP是指相同长度的单链DNA因其碱基序列不同，甚至单个碱基不同，都可能形成不同的空间构象，从而在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时泳动速率不同的现象。 PCR-SSCP分析 是指PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。﹣+纯合突变杂合突变正常人Leber 遗传性神经病患者 PCR/SSCP分析 （线粒体DNA第11778位G→A所致）（三）、基因测序(gene sequencing) 即测定某一基因的碱基序列。 实验流程：提取DNA→