病毒性传染病实验室诊断技术进展.pptx

分子生物学诊断技术进展;主要内容：;病原学检测常用的实验室技术;分子生物学诊断技术方法简介;分子诊断技术方法简介;分子诊断技术方法简介;分子诊断的功能及扩展;分子诊断的功能及扩展;分子诊断的功能及扩展;分子诊断的功能及扩展;分子诊断的功能及扩展;分子诊断的功能及扩展;耐药病原的分子诊断;血制品筛查;在基础研究领域中的应用； 遗传病的基因诊断和产前基因诊断： 如血友病、地中海贫血等 肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测； 骨髓移植、器官移植供体配型选择； 法医学、动植物学、古人类学、古生物学； 与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激素、受体）的基因表达的检测； 药物基因组学、耐药基因的检测，等等;简单介绍实验原理;PCR原理:实质就是体外基因复制技术;PCR 循环 第一步 – 加热变性;PCR 循环 第二步–引物与靶序列退火;PCR 循环 第三步 - 引物延伸;第1个PCR循环完成后;30次循环后靶序列扩增的数量;;5’;定量PCR测定的是扩增的指数扩增期; 定性PCR测定的是扩增的终点（平台期）;市场上常见的实时荧光PCR仪;临床标本;;NASBA 和 PCR 的不同;乙型肝炎检测标志物： HBsAg，抗-HBs, HBeAg，抗-Hbe, 抗HBc (IgG,IgM), HBV-DNA;乙型肝炎的分子诊断; 2. HBV基因型与血清型关系及流行病学分布 基因型与血清型不完全一致 临床突变率不同 有地域分布特点;表1：;表1(续）:; 3. 基因型与临床 实验室表现不同（表2） 病情与转归：C较B差 抗病毒治疗：A优于D B优于C adw/ayw 20:1;表2:; 4. 一般实验室分型方法 测序 PCR-RELP（限制性片断长度多态性） PCR 核酸杂交（谱线探针法） 血清学：单抗可区分A-F各基因型; 5. 抗病毒治疗的耐药性问题 拉米夫定耐药性的检测;拉米夫定耐药性的检测 耐药性与HBV多聚酶基因YMDD氨基酸序列中的核酸变异有关 I型：YMDD变异为HBV聚合酶基因(P区基因)区第741个核苷酸位,A-G置换，使第552个密码子蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)取代，成为YVDD变异 II型：YMDD变异为P基因区743个核苷酸的G-T置换，使第55个密码子蛋氨酸(M)被异亮氨酸(工)取代，成为YIDD变异 YMDD变异：Y（酪氨酸） M（蛋氨酸） V（缬）： YVDD变异 D（天冬氨酸） I（异亮）：YIDD变异 D（天冬氨酸） 最近报道： YSDD （ATG ?AGT ） 应用拉米夫定耐药位点基因芯片检测突变位点;乙型肝炎的分子诊断;乙型肝炎的分子诊断;HCV的基因型/亚型;HCV基因分型方法;5’UTR (5’Non-Coding Region) 高度保守 HCV RNA诊断实验的常用区域 有一套良好的多态性特征，因此可用于基因分型 许多HCV分型商业试剂盒都采用该区进行分型 TRUGENE HCV 5’NC Genotyping Assay VERSANT HCV Genotyping Assay (LiPA);临床工作;;抗HCV的确认实验 确认的重要性（灰区的遗漏） 目的：解决血液筛查实验（如ELISA）的非特异性问题 方法：例如： PCR – 活动性病毒血症的检测是一个很好的检测方法 RIBA 3.0 – 抗体的确认 新流程：; ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ;靶序列来源: a. 单抗检出的TB抗原蛋白编码基因 b. TB特异性核酸片段克隆 c. 插入序列; 65KD，165bp; MPB64，240bp; IS6110，123bp; IS986，245bp; 16sDNA，584bp.;? 标本处理 ：痰液化，抑制物去除 ? 试剂质控及灵敏度; 结核的PCR临床主要应用 a.结核与其他分枝杆菌区分 b.结核耐药基因 c.对含菌量低的标本的分离 d.为临床可疑者捕捉信息;? PCR方法与痰涂片及TB培养的比较 应做比对研究;RFP（利福平） INH（异烟肼） SM（链霉素） EMB（乙胺丁醇） PZA（吡嗪酰胺） 喹诺酮类;单耐药基因检测;同时对利福平、异烟肼这两种或