讲座2011全国分子细胞生物学实验技术培训班.pptx

会计学;讲座提纲;一. 科研选题及设计：以SCI为目标;如何选题;药物 前人的经验： 发现辛伐他汀有某种作用，能够治疗某种临床疾病， 且对其原理进行了研究，找到了相关基因。  我们的借鉴： 拜读大作后，联想到了阿托伐他汀，于是SCI处女作 出炉：阿托伐他汀对某疾病的治疗效果及其作用机制。  注：同一类的药物有那么多种，您完全可以换一种药 物拿来做一下试试。 ;机制 前人的经验： 发现某基因具有抗氧化应激的作用。  我们的借鉴： 拜读大作后，联想到氧化应激在好多疾病的病理机制 中都发挥作用，比如糖尿病肾病、糖尿病神经病变等 等，于是SCI处女作出炉：某基因在糖尿病肾病中的 作用。  注：注意串联联想： 基因 机制 临床疾病 基因 ;上下游基因 前人的经验： 发现A基因具有某种作用。  我们的借鉴： 拜读大作后???联想到A基因的上游或下游基因是B基 因，是否也有这种作用？于是SCI处女作出炉：B基 因具有某种作用。 注： 需要一定的知识基础，但相对于机制来说简单一点。 ;家族基因或者相同作用的基因 前人的经验： 发现某种药物能够对TNF-α产生影响。  我们的借鉴： 拜读大作后，联想到IL-6以及CRP都是炎症因子，有 可能这种药物对IL-6以及CRP也有影响，于是SCI处女 作出炉：某种药物对IL-6以及CRP的影响。 注：有相同作用的基因有很多，注意联想。 ;如何设计自己的课题;二. 临床样本在基因功能研究中的作用;收集临床样本;确定预研究的目的基因后，如何设计课题？ 基因功能研究的两方面： A. 基因的过表达---基因表达上调； B. 基因的RNA干扰---基因表达下调。 两者相辅相成，互为佐证。 紧贴临床疾病的基因治疗这一目的。 ;三. RNA干扰技术在基因功能研究中的应用;RNA干扰实验流程图;3.1 靶位点的选择 shRNA序列设计; Yrbio shRNA库 让您的RNAi实验有一个良好的起点！ 真正做到事半功倍！ 包含TRC、Ambion等多个组织或机构开发的shRNA库； 针对人及小鼠数万个基因，每个基因提供3~5条shRNA； 库中shRNA有效率高达75%！大部分shRNA干扰效率超过80%！;3.2 shRNA表达载体构建;第18页/共86页;赢润shRNA表达系统 （1）shRNA序列数据依然来自TRC、Ambion shRNA数据库， 质量有保证，靶位点成功率高。 （2）您可以选择构建一条或者多条shRNA，灵活度高。 （3）多种启动子，有荧光或无荧光，绿色荧光或红色荧光等 可自由选择，能够更好地配合后续实验。 （4）载体既可作为普通shRNA表达载体使用，亦可作为腺病 毒或慢病毒包装系统的穿梭载体使用，以进行腺病毒或慢病毒 包装。;第20页/共86页;第21页/共86页;第22页/共86页;mirshRNA表达载体;3.3 筛靶：确定最有效的shRNA;3.3 筛靶：确定最有效的shRNA;3.4 转染或感染目的细胞，表达shRNA;3.4 转染或感染目的细胞，表达shRNA;腺病毒包装体系;第29页/共86页;慢病毒包装体系;慢病毒表达载体;第32页/共86页;4.5 检测或验证RNA干扰效果;4.6 RNA干扰回复实验;按照Nature的标准，一个严格的RNAi实验要有6个对照： （1）转染试剂对照（监控转染及培养条件对结果的影响）； （2）nonsense siRNA对照（监控外源核酸本身对结果的影响）； （3）positive siRNA对照（监控假阴性）； （4）技术重复对照（也叫off-target对照，也就是利用至少2个靶点的 siRNA同时实验，2个siRNA互为off-target control，当两者的表型相同时， 才有可能是特异性的RNAi效应）； （5）rescue对照（RNAi之后做过表达，看是否有性状的逆转，这也是为 了说明RNAi的特异性）； （6）全表达组扫描对照（转录/表达芯片扫描，以最终确定表型不是 由于off-target造成）。;如何进行RNA干扰回复实验;3.7 动物模型实验;四. RNA干扰技术在发表SCI论文中的应用;研究实例一;Methods;细胞小室实验 检测侵袭转移能力;Results;Western-blot：;细胞存活率：;细胞小室实验：;动物模型：;HE染色：;PCNA：;研究实例二;Methods;动物处理;Results;第53页/共86页;第54页/共86页;第55页/共86页;第56页/共86页;第57页/共86页;第58页/共86页;研究实例三;Methods;Results;文章思路;研究实例四;文章思路;Methods;Methods;Results;第68页