凝胶色谱法的原理和方法血红蛋白的提取和分离.pdfVIP

2009 年江苏省洪泽中学高三生物第一轮复习教学案 高三生物备课组 【课 题】： 课题 6 血红蛋白的提取和分离 【备 课 人】： 【备课时间】： 【上课时间】： 【课 型】：复习 【课 时 数】： 1 课时 【复习目标】 本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离， 使学生能够体验从复杂体系中提取生物 大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习 运用这些技术打下基础。 【复习重点与难点】 复习重点：凝胶色谱法的原理和方法。 复习难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。 【知识回顾】： 一、实验原理 蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差 万别，由此提取和分离各种蛋白质。 1．凝胶色谱法（分配色谱法） ： （1）原理：分子量 大 的分子通过 多孔凝胶颗粒的间隙 ，路程短 ，流动快 ；分子量 小 的分子 穿过 多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢 。 （2 ）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 （3）分离过程： 混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子 ＊ 洗脱 ：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 （4 ）作用： 分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。 2．缓冲溶液 （1 ） 原 理 ：由 弱 酸 和相 应 的 强 碱弱 酸 盐 组成（ 如 H2CO3 － NaHCO 3 ， HC － NaC ， NaH2PO4/Na2 HPO4 等），调节酸和盐的用量，可配制不同 pH 的缓冲液。 （2 ）缓冲液作用： 抵制外界酸、碱对溶液 pH 的干扰而保持 pH 稳定。 3．凝胶电泳法： （1）原理： 不同蛋白质的 带电性质、 电量、形状和大小 不同， 在电场中受到的作用力大小、 方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 （2 ）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 1 2009 年江苏省洪泽中学高三生物第一轮复习教学案 高三生物备课组 （3 ）分离过程：在一定 pH 下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的 SDS，形成 “蛋白质－ SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 二、实验步骤 1．样品处理 ① 红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是 去除杂蛋白 ，采集的血样要及时采用 低速短时间 离心分离红细胞，然 后用胶头吸管吸出上层透明的 黄色血浆 ，将下层暗红色的 红细胞液体 倒入烧杯，再加入 五倍体 积的生理盐水 ，缓慢搅拌 10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至 上清液中没有黄 色 ，表明红细胞已洗涤干净。 ②血红蛋白的释放 在 蒸馏水 和 甲苯 作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。 注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有 利于血红蛋白的释放和分离。 2．粗分离 ①分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为 4 层。第一层为无色透明的 甲苯层 ，第 2 层为白色薄层固体， 是脂溶性物质的沉淀层 ，第 3 层是红色透明液体， 这是 血红蛋白的水溶液 ， 第 4 层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液 漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液