PCR技术详细介绍.ppt

实验目的 掌握PCR的基本原理及基本步骤方法 熟悉PCR的操作和仪器的使用 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 具体反应体系（25 μl ） 模板：1μl 引物：各1 μl dNTP：2 μl Buffer：2.5 μl Taq酶：0.5 μl 去离子水：17 μl 本节难点 引物的设计 打开软件界面，找到储存好的目的序列 引物的设计 利用PCR技术进行目的基因获取的基本思路 利用PCR技术实现DNA序列的定点突变 思考题 1、PCR技术的基本原理是什么？其影响因素分别有哪些？ 2、引物设计的主要原则和注意事项是什么？ 3、PCR技术的主要用途有哪些？ PCR的应用 PCR的应用 利用引物设计实现定点突变 * 基础部生物化学与分子生物学教研室 目 录 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR技术简史 PCR的类型和应用 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 标准的PCR反应体系 dNTP混合物 引物 　　　　 　 模板DNA 　　　 Taq DNA聚合酶 Mg2+ 　　　　　 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 DNA变性 形成2条单链 模板DNA 95℃ PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 55℃ 引物1 引物2 DNA引物 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 第1轮结束 95℃ 第2轮开始 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 Taq Taq Taq Taq PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第2轮结束 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA 循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 （3）延伸 70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加 PCR技术简史 聚合酶链反应的发明 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖 引物设计： （1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。 3’ 5’ 3’ 5’ 限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变