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医学免疫学实验指导：沉淀反应 【内容】 六、环状沉淀试验 七、单向免疫扩散试验 八、双向免疫扩散试验 九、对流免疫电泳试验 十、火箭免疫电泳试验 十一、免疫电泳试验 可溶性抗原（如毒素、血清蛋白、细胞碎片）与相应抗体特异性结合，在两者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下，可形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。可溶性抗原与相应抗体相比，抗原分子小，故抗原的反应面积大，为使抗原抗体比例适当，一般应稀释抗原。 试验 、环状沉淀试验 （Ring precipitation test） 将高浓度的抗血清置于直径较小的环状沉淀管中，再缓缓加入血清，使二者间有一清晰界面。如抗原抗体相对应，一段时间后，在液面交界处可形成白色沉淀环。 此试验常用于抗原的定性试验，如诊断炭疽的Ascoli试验、鉴定血迹、测定媒介昆虫的嗜血习性等。 【材料】 1、兔抗人血清、人血清、牛血清、生理盐水。 2、毛细吸管、环状沉淀管及环状沉淀管架。 【方法】 1、取环状沉淀管三支置于环状沉淀管架上，做好标记。用毛细吸管加入兔抗人血清各0.2ml于管底。 2、用毛细吸管分别吸取人血清、牛血清、生理盐水0.2ml，沿试管壁缓缓加入三支沉淀管，使两层液体之间有一明显的交界面。 3、室温下静置10~20分钟，观察结果。 【结果】 观察各管两层液体交界面有无白色沉淀环出现，有白色沉淀环的为阳性。（图4—5） 【注意事项】 加下层兔抗人血清时应注意将毛细吸管管口置于沉淀管底，避免气泡产生；加上层液体时毛细吸管不能接触到下层液体，吸管口靠在沉淀管壁上缓缓加入，否则不能形成清晰界面。 试验 、单向免疫扩散试验 （Single immunodiffusion test） 此试验属定量试验，通常以已知抗体测定未知抗原。试验中先将某种已知抗体混合于琼脂中，制成含抗体的琼脂板，再于琼脂板上打孔，将需检测的一定量的抗原加入孔中。在反应过程中，抗体已经均匀分布在琼脂板中，只有抗原向四周呈辐射状扩散，故称为单向免疫扩散试验。如果抗原抗体相对应，则在比例适当的地方出现一白色的沉淀环。沉淀环的直径大小与抗原的浓度成正比。以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗体反应后测得沉淀环的直径作为纵坐标，以抗原的浓度作为横坐标可绘制标准曲线图。测出待侧抗原在相同条件下的沉淀环直径，即可从标准曲线中求出其含量。此试验主要用于检测血清中各种Ig和补体成分的含量。 【材料】 1、标准参考血清：冻干正常人混合血清，其中IgG含量为经标准标定的已知量，用以制作标准曲线。 2、IgG诊断血清。 3、待检标本：人血清。 4、1.5%琼脂盐水、PBS、载玻片、直径3mm打孔器、微量加样器、湿盒、半对数坐标纸。 【方法】 1、免疫琼脂板的制备：将适宜浓度的诊断血清与预先溶化好的并保存于56℃水浴箱中保温的1.5%琼脂盐水按一定比例混合后，立即浇注在载玻片上，每块3.5ml（厚度2mm），置室温冷却凝固制成免疫琼脂板。 2、打孔：用直径3mm打孔器在琼脂板上打孔，孔间距为15mm，孔内琼脂用打孔器的针尖挑出。 3、加样：取冻干参考血清一支，加入0.5ml蒸馏水溶解，用0.01mol/L pH7.2~7.4PBS倍比稀释成1:10~1:160五种浓度。用微量加样器分别取10μl不同浓度的参考血清准确加入免疫板的孔内，每一浓度加2个孔，然后用同样的方法取10μl事先用PBS1:40稀释的待检血清加入孔内，每份标本加2个孔。 4、反应：将加样的琼脂板置湿盒内，放37℃恒温箱24—48小时后取出，测量各孔沉淀环直径并作记录。（图4—6） 【结果】 以所加各种浓度参考血清的沉淀环直径为纵坐标，相应孔中IgG浓度为横坐标，在半对数纸上作图，绘制标准曲线。根据待检血清的沉淀环直径，从图上可查出IgG浓度。查得的浓度乘以标本的稀释倍数即可得该标本IgG的浓度（图4—7） 【注意事项】 制备琼脂板时温度不宜太高以免抗体变性失活，也不宜太低以免使琼脂凝固不匀。 制备琼脂板时，载玻片一定要置于水平位置。 孔要圆整、光滑，孔中琼脂不能与载玻片分离。 时间要适当。时间过短，沉淀线不能出现；时间过长，沉淀线解离或散开，影响结果判断。 测量沉淀环直径必须准确，以mm为测量单位。 试验 、双向免疫扩散试验 （Double immunodiffusion test） 此法为定性试验。将抗原、抗体分别加入琼脂板相对应的小孔中，两者各自向四周扩散，在比例适当处形成可见的白色沉淀线。如果所加抗原、抗体标本中有多对抗原抗体系统，则因各种抗原的扩散系数和各对抗原抗体间的最适比例不同，以及抗原抗体复合物所形成的沉淀线具有选择性渗透屏障作用，扩散后可以形成若干条沉淀线，一条沉淀线代表一对抗原抗体。因此观察沉淀线的位置、数量、形状，以及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析。此试验常