血红蛋白的提取与分离.ppt

①固定：将色谱柱处置固定在支架上 ②装填： 将（ ）一次性的缓慢倒入（ ）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 （3）凝胶色谱柱的装填方法 凝胶悬浮液 色谱柱 注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 ③洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在( )高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分（ ）12小时。 洗涤平衡 注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。 50cm 3）样品加入与洗脱 ①加样前 打开下端出口，使柱内凝胶面上的（ ）缓慢下降到与（ ）平齐，关闭出口 缓冲液 凝胶面 ②加透析样品 ①调整缓冲液面：与凝胶面平齐 ②滴加透析样品：用（ ）将1ml（ ）的样品加到色谱柱的（ ） ③样品渗入凝胶床：（ ） ④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱 ⑤收集：待（ ）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（ ）收集一试管连续收集 注意正确的加样操作： ①不要触及破坏凝胶面 ②贴壁加样 ③使吸管管口沿管壁环绕移动 吸管 透析液 顶端 样品完全进凝胶层 5ml 红色的蛋白质 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 思考 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（ ）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（ ）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（ ）。 思考 样品的粗分离 纯化 纯度鉴定 * 尼龙管 * 思考 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。 蛋白质的提取和分离一般分为四步： 样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定 凝胶色谱法 电泳 透析 二 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步： 1.样品处理 血液 血浆 水分 固体物质 血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等 血细胞 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 血红蛋白 （ ） 两个a－肽链 两个β一肽链 样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定 共四条肽链 90％ ①目的：去除（ ） ②方法：（ ）离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（ ），将下层（ ）的红细胞液体倒入（ ） (1)红细胞的洗涤 杂质蛋白 低速短时间 黄色血浆 暗红色 烧杯 再加入用（ ）的（ ）质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤 ⑤低速离心（低速短时间） ⑥重复4、5步骤（ ）次，直至上清液中已没有（ ），表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。 五倍体积 生理盐水 三 黄色 (2)血红蛋白的释放 加（ ）到（ ）体积，再加40％体积的（ ）（ 溶解细胞膜） ，置于（ ）上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白. (3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层: 原血液 甲苯 磁力搅拌器 蒸馏水 第1层（最上层）： （ ）甲苯层 第2层（中上层）： （ ）的沉淀层，