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HPLC原理及操作详解 HPLC原理及操作详解 HPLC原理及操作详解 高 效 液 相 色 谱 我国药典收载高效液相色谱法工程和数量比较表： 方法 工程 数量 1985 年版 1990 年版 1995 年版 2000 年版 鉴别 9 34 150 HPLC法 检查 12 40 160 含量测定 7 60 117 387 基于 HPLC应用在药品解析中越来越多，所以每一个药品解析人员应该掌握并应用 HPLC。 ．概论 一、液相色谱理论睁开简况 色谱法的分别原理是：溶于流动相 (mobile phase) 中的各组分经过固定相时，由于与固定相 (stationary phase) 发生作用〔吸附、分配、 离子吸引、排阻、亲和〕的大小、强弱不一样，在固定相中滞留时间不一样， 进而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特〔 Tswett 〕在 1906 年研究用碳酸钙分别植物色素时发现的， 色谱法 (Chromatography) 因之得名。此后在此基础上睁开出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室平易常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长〔常有几个小时〕。高效 液相色谱法 (High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色 谱法的基础上，于 60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速睁开起来的。它与经 典液相色谱法的差异是填料颗粒小而平均， 小颗粒拥有高柱效，但会引起高阻力， 需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法 (High Pressure Liquid Chromatography， HPLC)。又因解析速度快而称为高速液相色谱法 (High Speed Liquid Chromatography ，HSLP)。也称现代液相色谱。 二、 HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点： 2 2 高压——压力可达 150~300 Kg/cm 。色谱柱每米降压为 75 Kg/cm 以上。 高效——可达 5000 塔板每米。在一根柱中同时分别成份可达 100 种。 高矫捷度——紫外检测器矫捷度可达。同时耗资样品少。 HPLC与经典液相色谱对照有以下优点： 速度快——平时解析一个样品在 15~30 min ，有些样品甚至在 5 min 内即可达成。 分辨率高——可选择固定相和流动相以到达最正确分别收效。 矫捷度高——紫外检测器可达，荧光和电化学检测器可达。 柱子可屡次使用——用一根色谱柱可分别不一样的化合物。 样品量少，简单回收——样品经过色谱柱后不被损坏， 能够收集单一组分或做制备。 三、色谱法分类 按两相的物理状态可分为： 气相色谱法 (GC)和液相色谱法 (LC) 。气相色谱 法适用于分别挥发性化合物 。GC依照固定相不一样又可分为气固色谱法 (GSC)平易液色谱法 (GLC)，其中以 GLC应用最广。液相色谱法适用于分别低挥发性或非挥发性、热牢固性差的物质。 LC同样可分为液固色谱法 (LSC) 和液液色谱法 (LLC) 。其他还有超临界流体色谱法 (SFC)，它以超临界流体〔界于气体和液体之间的一种物相〕为流动相〔常用 CO2〕，因其扩散系数大，能很快到达平衡，故解析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。 按原理分为吸附色谱法 (AC) 、分配色谱法 (DC)、离子交换色谱法 (IEC) 、排阻色谱法 (EC，又称分子筛、凝胶过滤 (GFC)、凝胶浸透色谱法 (GPC〕和亲和色谱法。〔其他还有电泳。〕 按操作形式可分为纸色谱法 (PC)、薄层色谱法 (TLC) 、柱色谱法。 四、色谱分别原理 高效液相色谱法按分别体系的不一样分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法 〔正相与反相〕、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1．液固色谱法 使用固体吸附剂，被分别组分在色谱柱上分别原理是依照固定相对组分吸附力大小不一样而分别。分别过程是一个 吸附－解吸附 的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝， 粒度 5~10μm。适用于分别分子量 200~1000 的组分，大多数用于非离子型化合物， 离子型化合物易产生拖尾。 常用于分别同分异构体。 2．液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相， 分别原理是依照被分其他组分在流动相和固定相中溶解度不一样而分别。分别过程是一个 分配平衡 过程。 涂布式固定相应拥有优秀的惰性； 流动相必定起初用固定相饱和， 以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不一样批号流动相的差异常引起柱子的变化； 其他在流动相中存在的固定相也使样品的分别和收集复杂化。 由于涂布式固定相很难防范固定液流失，现在已很少采用。现