流式细胞术的原理和应用.ppt

流式细胞术的原理和应用;内 容;一、免疫学检测的根本原理;2021/1/12;二、细胞因子检测方法;〔一〕细胞因子的临床意义;〔二〕常规检测方法;1.分子生物学测定法;分子杂交技术;多聚酶链反响技术〔PCR〕;PCR原理;;反转录PCR〔Reverse transcription PCR，RT-PCR);RT;RT-PCR反响过程;RT反响体系;PCR反响体系;RT-PCR反响产物检测;实时荧光定量PCR(Fluorescence Quantified real time PCR);〔1〕原理;1) 常用名词概念;扩增曲线;设定荧光域值;荧光阈值〔threshold〕;Ct值;Ct值确实定;Ct值与起始模板的关系;〔2〕常用标记方法;SYBR Green I染料法;SYBR Green I染料法原理;本卷须知;结果断定——融解曲线;2021/1/12;〔3〕qPCR结果分析——相对定量解析;1〕相对定量的必要性;必须用内对照基因〔管家基因〕进展校正;2〕管家基因挑选;3〕分析方法;1〕双标准曲线法;2021/1/12;优缺点;2〕 2 -△ △Ct法;2 -△ △Ct法：假设目的基因、对照基因扩??效率均是100% △Ct〔处理前/对照组〕=18-17=1 △Ct〔处理后/实验组〕 △ △ Ct= △Ct〔处理后〕-△Ct〔处理前 比率〔处理后/处理前〕= 2 -△ △Ct=2 - -2.4 结论：JUN处理后表达程度是处理前的倍 修正：扩增效率不是1，而是E， 2 -△ △Ct可修正为〔1+E〕 -△ △Ct;优点;2. 生物活性检测法 ;〔1〕依赖性细胞株 ;〔2〕功能检测 ;A. 增殖或增殖抑制法 ;B. 集落形成法 ;C. 直接杀伤靶细胞 ;D. 抗病毒效应;E. 趋化作用;F. 抗体形成法;; 一般方法;;对生物学活性测定法的评价;3. 免疫化学测定法 ;;2021/1/12;〔三〕胞内细胞因子检测方法;活化剂;人外周血单个核细胞IL-17A流式检测方法 ;;; 图1. 表达IL-17和IFN-?的CD4+T细胞分析 ;〔四〕细胞因子检测的临床应用 ;三、常用免疫细胞功能检测方法;内容;〔一〕淋巴细胞功能检测;淋巴细胞;;1. T细胞功能检测;〔1〕T淋巴细胞增殖试验; 未转化和转化淋巴细胞的形态特征;2021/1/12;B. 刺激物;T细胞;常用方法;形态计数法;;方法评价;同位素掺入法;SI＝PHA刺激管cpm均值/对照管cpm均值;CCK8法 (Cell Counting Kit 8);;(2) T细胞分泌功能测定;(3)T细胞介导的细胞毒实验;A.原理：;形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞 计数残留肿瘤细胞 同位素法 ：淋巴细胞〔CTL〕+含51Cr 的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏 51Cr 释放 测定γ射线;;〔4〕体内试验;2. B细胞功能检测;(1) B细胞增殖才能检测;〔2〕体外抗体形成细胞检测;溶血空斑试验;原理;;B细胞抗体形成功能的检测 ——酶联免疫斑点法;;(4)体内实验;;〔二〕吞噬细胞功能检测;1.中性粒细胞的功能检测;(1) 细胞运动功能——趋化功能检测;方法：;(2)吞噬和杀菌功能测定;NBT复原试验;2、巨噬细胞功能检测;〔2〕吞噬功能检测;〔3〕巨噬细胞溶酶体酶的测定;〔4〕细胞毒作用测定;〔三〕临床应用;;汇报完毕