第3章细胞生物学研究方法.pptxVIP

第三章;;1.分辨率(resolusion)：区分两个质点间的最小距离。R=0.61λ/n sinα/2 其中: n=标本和物镜之间介质折射率; λ=入射光线波长； α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） nsinα/2称为物镜的数值孔径(numerical aperature, NA) R=0.61λ/NA 思考题：如何提高显微镜的分辨能力？;;2.放大倍数(magnification):最终成像的大小与原物体大小的比值。 光学显微镜的最大放大倍数为1,000倍. 电子显微镜的最大放大倍数为1,000,000.;一、光学显微镜;（二）相差显微镜;;Figure 3-2. Interference between light waves. When two light waves combine in phase, the amplitude of the resultant wave is larger and the brightness is increased. Two light waves that are out of phase partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and therefore brightness, is decreased. ;1.原理：利用光的衍射和干涉特性使相位差变成振幅差，表现为明与暗的对比。 2.两个特殊构件： 环状光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。 相位板（annular phaseplate）：涂有光吸收物质和相位推迟物质。;1.原理：利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。 ;;2.应用： 适于研究活细胞中较大的细胞器、颗粒及其运动。 计算机辅助的DIC分辨率比普通光镜提高了一个数量级。应用这一原理制备的录像增差显微镜（video-enhance microscopy）可以观察微管上颗粒的运动。;（四）荧光显微镜 ;1.原理：以紫外线为光源照射被检物体，使之发生荧光，然后在显微镜下观察物体的形态及其所在的位置。 2.特点：光源不直接照明，而是激发能源；需特殊的滤色镜；分辨率高。 3.用途：在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性、定位。?既可以观察切片，也可以进行活体观察。有免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。 ;Fluorescence image of epithelial neuron cell ;Singapore’s National Institute of Education ;（五）激光扫描共聚焦显微镜 ;1.原理：激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描，获得样品不同层面的图像（称为光切片），再通过计算机组合成三维重构的影像。 2.优点：分辨能力比普通光学显微镜提高1.4-1.7倍。 3.用途：类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像，在研究亚细胞结构与组分方面广泛应用。;laser confocal scanning microscope, LCSM;;（六）倒置显微镜 ;; (七)荧光共振能量转移技 (Fluorescence resonance energy transfer, FRET);490nm荧光;; (八)荧光漂白恢复技术;暗视野显微镜 （dark field microscope）;（九）当代显微镜的发展趋势; 1932年德国学者Max Knolls和Ernst Ruska用波长比光短得多的电子作光源,发明了第一台电子显微镜，大大提高了显微镜的分辨率，开拓了超微世界。 光学显微镜中观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构称为亚显微结构（submicroscopic structure）或超微结构（ultra structure）。;1.基本构造: (1)电子枪：包括灯丝阴极和阳极。阴极电压50~120KV，阳极0V，两极电压差为加速电压。电子束波长与加速电压的平方根成反比。 (2)电磁透镜：改变电子方向。 (3)真空系统：保持电镜真空。 (4)照相系统：;显微镜;电镜与光镜光路图比较;透射电子显微镜;;(2)扫描电子显微镜（Scanning electron microscope，SEM）; ????????????????????????????????????????????????????Figure 3-32. Cells in culture. Scanning electron micrograph of rat fibroblasts growing on the plastic surface of a tissue-