第七章基因结构与表达分析的基本策略ppthylogen.pptxVIP

第七章基因结构与表达分析的基本策略Strategy for Structure and Expression Analyses of Genes主讲人：罗志勇 教授概 论 1. DNA双螺旋结构发现（Watson ＆Crick,1953）The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1962Presentation Speech by Professor A. Engstr?m Dr. Francis Crick, Dr. James Watson, Your discovery of the molecular structure of the deoxyribonucleic acid, the substance carrying the heredity, is of utmost importance for our understanding of one of the most vital biological processes. Practically all the scientific disciplines in the life sciences have felt the great impact of your discovery. The formulation of double helical structure of the deoxyribonucleic acid with the specific pairing of the organic bases, opens the most spectacular possibilities for the unravelling of the details of the control and transfer of genetic information. Central Dogma2.中心法则提出（Crick，1958）Crick,1916-2004补充的中心法则反转录机制阐明（ Temin 1970 ）中心法则： 代表了大多数生物遗传信息贮存和表达的规律，奠定了从分子水平研究生命科学关键问题的理论基础。3.基因表达（gene expression）： 从DNA到蛋白质，通过转录和翻译，用基因的遗传信息在细胞内合成有功能意义的各种蛋白质。DNA序列分析※ Southern blot ※DNAFISHNorthern blot ※Real -time RT –PCR ※基因芯片RNAWestern blot※ 蛋白质芯片蛋白质4.基因结构与表达分析技术： 讲授内容：(Ⅰ)DNA序列分析※(Ⅱ)核酸分子杂交※(Ⅲ) 基因芯片和微阵列 (Ⅳ) Western免疫印迹※(Ⅴ) 聚合酶链式反应※一、DNA序列分析（一）双脱氧链末端终止法※ (Sanger ,1977)（二）化学裂解法 (Maxam ＆Gilbert ,1977 )（三）DNA自动化序列分析 ● 高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）技术 ● PAGE能分离长度为300-500个碱基,差别仅1个碱基的单链寡核苷酸DNA片段。DNA测序技术基础：共同分享Nobel化学奖(1979)(Sanger, UKMaxam ＆Gilbert, USA)(一）双脱氧链末端终止法（dideoxy chain termination） 以DNA合成反应为基础。(Sanger)ATPdATPddATP ATP、dATP和ddATP的结构DNA合成反应 掺入N个核苷酸掺入N+1个核苷酸1. 双脱氧末端终止法原理 DNA合成反应中，ddNTP不存在3′-OH末端，故不能与下一个核苷酸的5′-P端形成3′，5′-磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸提前终止于ddNTP 。 末端终止部位引物DNA单链模板延伸的新合成链 掺入ddNTP ● 单链DNA模板的制备 ● DNA模板与测序引物退火● 掺入法标记反应● 延伸-终止反应● 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳● 放射自显影● 阅读测序结果2. DNA测序主要步骤测序步骤A反应管G反应管T反应管C反应管G反应管 G A T C（二）化学裂解法 与末端终止法不同，化学降解法是建立在对原有DNA的化学降解过程基础上。 1.化学裂解法原理 将待测DNA片段3′或5′端进行同位素标记，标记的DNA片段分成四个反应，分别用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性切割，使DNA片段分别于某一种碱基处断裂。硫酸二甲酯哌啶 化学降解G反应模式图 MetMetMetMet（三）DNA测序自动化原理 采用4种不同的荧光分别标记4种ddNTP终止反应产物，替