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微生物基本技术操作要求！ 一、无菌操作要求 微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多实验要求在无菌的 条件下进行，主要原因，一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工 作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。要求如下： 1.1 接种细菌时必须穿工作服、带工作帽； 1.2 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌 室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用； 1.3 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用酒精棉球将手 擦干净； 1.4 进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未 使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用酒精点燃烧 灼三次后使用； 1.5 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及试管或平皿边； 1.6 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌活样品时，吸管 从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒； 1.7 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到 针和环与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸 5min，再经火焰烧灼； 1.8 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。 二、无菌间使用要求 2.1 无菌间应密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及 门，另尽量设有的小窗，以备进入无菌间后传递物品。 2.2 无菌间应保持清洁，工作后用煤酚皂液溶液消毒，擦拭工作台面，不 得存放与试验无关的物品； 2.3 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬掉紫外灯消 毒时，需 30W紫外灯，距离工作台 1m处，照射时间不少于 30分钟，使 用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两 周需用酒精球轻轻擦拭，除去上面的灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影 响； 2.4 处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传 递物品，可通过小窗传递； 2.5 在无菌间需用安装空调时，则应有过滤装置。 三、消毒灭菌要求 微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物 等，必须经灭菌后方能使用。 3.1 灭菌前准备 3.1.1 所有需经灭菌的物品首先要清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸 包装严密，如用金属筒应将上面气孔打开。 3.1.2 装培养基的三角瓶塞好棉塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将 管芯抽出，用纱布包好。 3.2 装放 3.2.1 大型高压蒸气锅：放置灭菌物品不应超过锅内容积的 80%，物品应 放置锅内搁架上或铁丝筐中。 3.2.2 手提式高压锅：将物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间 不能过挤。 3.3 设备检查 3.3.1 检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。 3.3.2 压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热 后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵 塞。 3.3.3 对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序， 是否符合于进行灭菌处理的要求。 3.4 灭菌处理 手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行： 3.4.1 手提式高压锅在主体内加入 3L清水，立式高压锅加水 16L （重复使 用时应将水量补足，水变混浊需要更换）。 3.4.2 手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管 或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。 3.4.3 盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通 上电源，并打开顶盖上的排气阀放出冷气（水沸腾后排气 10～15min）。 3.4.4 关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌 物品性质与有关情况而定）。 3.4.5 达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸汽，待 压力恢复到零时，自然冷却至 60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开 排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到 60℃以下再打开盖取物，以防止突然减压液体剧烈沸腾活容器爆破。 3.5 灭菌温度与时间 3.5.1 压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间见下表： 灭菌时间，min 物 品 115℃ 121℃ 不含糖等耐热培养