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WesternBlot实验步骤-医药卫生 Western Blot实验步骤 Western Blot 操作步骤： （一） 蛋白样品制备 选TRIZOL 法 （二） 蛋白含量的测定 （1） 制作标准曲线 1、 从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 2、 取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0 g，2.5 g，5.0 g ，10.0 g ， 20.0 g ，40.0 g。 4、 混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计（Bio－Photometer，Eppentoff） 上比色分析。 5、 （2） 检测样品蛋白含量 1、 取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置 30min后即可用于测蛋白。 2、 取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 l，混匀放置2分钟可做为空白 样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。 3、 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。 4、 取一管考马斯亮蓝加95 l 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5 l待测蛋白样品，混 匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample检测样品。 注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 l样品含的蛋白量。 （1） 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。 （2） 灌胶与上样 1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要 使两玻璃对齐，以免漏胶。） 2、 按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时， 可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。 然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面 Western Blot实验步骤 快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才 不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。） 3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固 就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 4、 按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空 间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以 免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收 缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经 常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻 轻将其拔出。 5、 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板 面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向 外。） 6、 测完蛋白含量后，计算含50 g蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样 品至0.5ml离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总 体积一般不超过15 l，加样孔的最大限度可加20 l样品。）上样前要将样 品于沸水中煮5min使蛋白变性。（ 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分 变性蛋白。 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS胶加样孔内 即可）（为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小， 最好使用预染蛋白质分子量标准） 7、 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。） 用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插 至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也 可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤 3次，以免交叉污染。 （3） 电泳 （电泳时间一般4～5 h，电压为40V较好，也可用60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。） 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在12